向日葵列当效应子编码基因及寄主识别中的抗性基因克隆与功能鉴定

It is well accepted that there is a gene-for-gene mode during the interaction between Orobanche cumana and sunflowers. O. cumana use effector gene to repress defense responses of host sunflowers during parasitization, whereas resistant sunflowers utilize resistant gene (R gene) to recognize effector gene and activate subsequent resistant responses. This study will use RNA-seq to investigate transcriptome of sunflowers and O. cumana during infection, and distinguish the intermixed reads of sunflower and O. cumana via mapping them to sunflower genome. Mapped reads belong to sunflowers while the unmapped belong to O. cumana. Then screen candidate R genes by comparing the transcripts between resistant and susceptible sunflowers. Meanwhile, de novo assemble the reads of O. cumana and translate them to protein for prediction of candidate effectors. Clone the full length cDNA of R gene and effector gene via RACE, silence R gene in resistant sunflower as well as effector gene in O. cumana via RNAi, and co-culture with O. cumana and susceptible sunflower respectively, to investigate the roles of R gene and effector gene during the interaction between sunflowers and O. cumana.

向日葵和向日葵列当（Orobanche cumana）互作过程中存在gene-for-gene的模式，即O. cumana通过效应子基因来抑制感性向日葵的防御反应，而抗性向日葵中存在着对应的抗性R基因来识别效应子基因，激活抗性反应。本项目拟采用RNA-seq技术检测O. cumana侵染寄主过程中向日葵感染部位和O. cumana的序列表达情况，通过将这些序列匹配到向日葵基因组上的方法，来区分两者的混合序列；在此基础上，结合O. cumana不同生长发育时期的转录情况以及相关基因的表达程度，筛选效应子编码基因；同时检测感性和抗性向日葵与O. cumana共培养后的转录情况，筛选向日葵的R基因；然后用RACE克隆效应子基因和R基因的全长cDNA，预测其功能；将GFP荧光蛋白与效应子蛋白融合，利用Agroinfiltration技术对效应子蛋白进行亚细胞定位，同时采用MS技术验证所筛选出的效应子蛋白的真实性；最后采用RNAi技术分别沉默O. cumana中的效应子基因和抗性向日葵中的R基因，来明确这些基因在O. cumana侵染过程中的作用。

本项目以向日葵列当（Orobanche cumana）的G生理小种，以及感性和抗性的向日葵品种为试验对象，采用RNA-seq技术，比较了向日葵列当侵染过程中感性和抗性向日葵品种的基因表达差异，发现防御相关基因显著富集于抗性向日葵品种的表达上调基因中，而在感性向日葵品种中富集于表达下调基因中，表明感性品种应对列当侵染时的防御反应不足，其中编码NBS-LRR家族蛋白、PR蛋白的基因，以及与转录因子相关的基因，特别是WRKY和MYB家族基因，在感性品种中表达量显著降低。分别鉴定了向日葵的WRKY和MYB家族基因，并在向日葵列当侵染时进行了基因表达检测，发现其与向日葵的抗性密切相关。通过分泌组预测的方法，筛选出了可能与向日葵列当侵染相关的180种蛋白质，主要包括细胞壁降解相关、病原相关、以及营养物质获取和激素相关蛋白。根据基因的表达程度，筛选出了一个包含PAR1结构域的向日葵列当蛋白作为候选效应子，是一类新的发病相关蛋白，采用RACE技术克隆出了该效应子基因的全长，其编码的蛋白质包含一个信号肽结构，用于不同物种细胞间的转移。该效应子在拟南芥中的同源蛋白与细胞壁修饰及抗性相关蛋白进行互作。采用瞬时表达技术，对克隆出的效应子蛋白进行了亚细胞定位，显示其作用部位主要在细胞膜和细胞核上,其在flg22处理后的植物叶片上进行瞬时表达，可以显著降低ROS水平，表明该效应子具有抑制植物防御反应的功能。本项目为揭示向日葵的抗性机制和向日葵列当的寄生机理奠定了一定基础，将有助于对抗性育种策略的构建，具有重要的科学意义。