小鼠单倍体胚胎干细胞倍性维持与分化研究

Haploid embryonic stem cells (haESCs) are derived from embryos that only have one copy chromosome. Organisms with a single copy of genome provide a basis for genetic analyses where any recessive mutation of essential genes will show a clear phenotype. However, no haploid somatic cells could be obtained in mammals, likely because haploid ESCs are prone to diploidization in culture and differentiation. Therefore, there are two major limitations for the application of haploid cells. One is the lack of appropriate culture system to maintain stable haploidy; the other is the lack of haploid somatic cells with specific functions for genetic screening. In this project, with activation or inhibition of crucial genes in cell cycle regulation, we aim to stabilize haploid ESCs and then derive functional haploid somatic cells, which can be used for creating a mutant library to screen drugs and study gene functions.

小鼠单倍体胚胎干细胞（haESCs）是借助胚胎操作技术，从只含一套染色体的胚胎中获得的细胞系。haESCs能替代精子高效地生产转基因鼠，而且由于只含一套染色体，有利于隐性纯合体的获得，可用于建立突变文库，高效地进行基因筛选以推动遗传学研究。然而，在现有的培养、分化体系下，haESCs单倍性难以稳定，染色体会自发加倍形成二倍体，严重制约其应用；而且由于二倍化严重，迄今为止还无法分化得到单倍体成体细胞。由于许多在成体细胞中发挥功能的基因在干细胞中并不起作用（如心肌动作电位相关的离子通道基因），如果能创造有特定功能的单倍体细胞模型，就能进行功能基因筛选，为人类疾病的治疗寻找靶点。本项目拟通过对细胞周期调控蛋白进行激活或抑制，解决haESCs在培养、分化过程中单倍性不稳定的问题，并阐明二倍化机制；在此基础上优化分化体系，获得有功能的单倍体成体细胞，用于建立突变文库，进行药物筛选和基因功能研究。

小鼠单倍体胚胎干细胞（haESCs）只含一套染色体，有利于隐性纯合体的获得，通过建立突变文库可高效地进行基因筛选以推动遗传学研究，还可以替代精子或卵子高效地生产转基因鼠，并用于印记基因的功能研究。然而，在现有的体系下，haESCs单倍性难以稳定，染色体会自发加倍形成二倍体，严重制约其应用。而且由于二倍化严重，无法分化得到单倍体成体细胞。由于许多在成体细胞中发挥功能的基因在干细胞中并不起作用（如心肌动作电位相关的离子通道基因），如果能创造有特定功能的单倍体细胞模型，就能进行功能基因筛选，为人类疾病的治疗寻找靶点。本项目拟通过对细胞周期调控蛋白进行激活或抑制，解决haESCs在培养、分化过程中单倍性不稳定的问题，并阐明二倍化机制；在此基础上优化分化体系，获得有功能的单倍体成体细胞，用于建立突变文库，进行药物筛选和基因功能研究。.我们经过活细胞观察发现，haESCs在分裂时会有一小部分细胞发生有丝分裂滑移，使细胞从中期直接进入间期，从而导致二倍化。以参与中期调控的周期蛋白为靶点，我们用小分子抑制剂和构建外源过表达质粒的方法调控基因的表达，进行了大量的筛选，发现CDK1和ROCK通路是调控haESCs二倍化的关键通路。通过添加CDK1抑制剂RO-3306和ROCK抑制剂Y-27632能减少haESCs在培养过程中的二倍化，并能将其分化为包括神经干细胞、心肌细胞和胰岛细胞在内的三个胚层单倍体体细胞，利用PiggyBac转座子系统构建的单倍体神经细胞突变库，可用于神经毒素Mn2+的抗性基因筛选，并证实Park2在神经细胞抵抗Mn2+神经毒性中有重要作用。.上述工作揭示了单倍体二倍化的发生机制，发现了CDK1与ROCK通路是调控二倍化进程的关键通路。在此基础上，通过使用小分子抑制剂获得了小鼠三胚层来源的单倍体体细胞，并展示了单倍体体细胞在遗传筛选中的重要价值。同时，该体系也为后续的单倍体细胞相关研究提供了可靠保障。