甘露糖基转移酶基因MaMnt1在金龟子绿僵菌侵染致病过程中的表达特征及功能研究

昆虫病原真菌是重要的生防资源，阐明其侵染致病的分子机制对于充分挖掘其生防潜力具有重要意义。在前期工作中，从感病蝗虫体内的金龟子绿僵菌的cDNA文库中，发现了一个编码甘露糖基转移酶基因MaMnt1。甘露糖蛋白是细胞壁的重要成分，其糖链分布在细胞最外层，保护细胞壁，是昆虫免疫识别病原真菌中的抗原物。甘露糖基转移酶是参与蛋白糖基化修饰过程的重要酶类。在人类病原真菌中，该基因通过影响细胞壁的结构和组成，进而影响毒力。在昆虫病原真菌中，对蛋白的糖基化修饰还缺乏研究，MaMnt1的功能尚不清楚。本项目将利用报告基因gfp，结合冷冻切片等技术，分析MaMnt1在金龟子绿僵菌侵染致病过程中的表达特征；采用RNAi和超量表达等技术，研究MaMnt1与金龟子绿僵菌毒力的关系。本项目研究将阐明MaMnt1在真菌侵染致病过程中的作用，有助于理解昆虫病原真菌侵染致病的分子机理，可望为菌株改良提供目的基因和理论依据。

昆虫病原真菌是重要生防微生物，其细胞壁主要由多糖和蛋白组成，糖基化修饰对细胞壁合成至关重要。本研究以绿僵菌为材料，克隆了一个甘露糖基转移酶基因MaMnt1及其上游启动子序列。利用MaMnt1启动子控制egfp的绿僵菌转化子进行MaMnt1的表达特征研究，发现MaMnt1在菌丝生长和侵染寄主过程中表达水平较高。进一步分析绿僵菌基因组，发现了另两个甘露糖基转移酶基因MaMnt2和MaMnt3。分别敲除MaMnt1、MaMnt2和MaMnt3进行逆境敏感性分析表明，MaMnt1缺失后绿僵菌的抗氧化能力下降明显，菌体的细胞壁完整性和抗高渗能力无变化；MaMnt2和MaMnt3的单缺失对菌体细胞壁完整性、抗高渗和抗氧化能力均无显著影响。毒力分析表明MaMnt1、MaMnt2和MaMnt3单敲除后对绿僵菌毒力无显著影响。为了明确MaMnt1、MaMnt2和MaMnt3三个基因之间的功能是否存在互补机制，通过软件分析从这3个基因的cDNA序列中分别选取一段干扰效率高且序列特异性好的序列进行串联，构建MaMnt1/2/3的共干扰载体，并转化绿僵菌，筛选得到MaMnt1/2/3的共干扰转化子。逆境敏感性分析发现，共干扰MaMnt1/2/3三个基因后菌体细胞壁完整性和抗氧化能力均显著降低，表明MaMnt1、MaMnt2和MaMnt3在维持绿僵菌细胞壁的完整性上存在功能上的互补。毒力分析发现，共干扰MaMnt1/2/3三个基因后绿僵菌毒力显著下降，表明MaMnt1、MaMnt2和MaMnt3在维持绿僵菌的正常侵染致病上也存在功能上的互补。真菌细胞壁中的多糖主要由葡聚糖、甘露糖和几丁质构成。葡聚糖合成酶为真菌细胞壁骨架成分——葡聚糖合成的关键酶。为进一步阐明细胞壁多糖的作用，本研究还克隆了绿僵菌的β-1,3-葡聚糖合成酶基因MaFKS并研究了其功能。与野生型菌株相比，MaFKS干扰转化子的细胞壁完整性和抗高渗能力显著下降，逆境条件下的产孢量显著降低。测定菌丝壁β-1,3-葡聚糖的含量，发现减少MaFKS的表达降低了绿僵菌菌丝壁β-1,3-葡聚糖的含量。本项目中有关MaFKS的研究内容已在SCI核心期刊上公开发表论文1篇，有关MNTs研究内容的英文初稿已撰写，预计能够在SCI核心期刊上公开发表。另外，在本项目的资助下已申请专利2项，其中1项已获权。所以，本项目达到了预期的研究目标。