Nrf2对糖尿病心肌病自噬稳态的调节作用及其机制研究

Diabetic cardiomyopathy (DCM) is one of leading causes of heart failure and death in diabetic patients. Excessive autophagy leads to myocardial injury, which may be a potential mechanism of DCM development. In addition to the anti-oxidative injury, the nuclear transcription factor Nrf2 can inhibit excessive autophagy by negative regulation of AMPK. In our previous study, lower Nrf2 expression and more autophagy lysosome was found in DCM mice cardiomyocytes, while increasing Nrf2 expression could improve myocardial function. We therefore hypothesize that the excessive autophagy is an important factor in myocardial injury of DCM, and increasing Nrf2 activity can inhibit excessive autophagy via inhibiting AMPK-ULK1-Beclin1 pathway, which is one of the key ways to block DCM myocardial injury. We intend to use Nrf2 gene knockout mice model and siRNA transfection in vivo and in vitro:① to determine the autophagy activity and its role during DCM progression; ② to elucidate the down-regulation of Nrf2 expression in DCM can enhance myocardial injury by activating autophagy through AMPK-ULK1-Beclin1 pathway; ③ Myricetin will be used to increase Nrf2 expression, which furtherly prove that Nrf2 inhibit excessive autophagy which is beneficial to reduce myocardial injury. The results will propose that in DCM, increasing Nrf2 can reduce autophagy by inhibiting AMPK, and provide a new direction for DCM prevention and treatment.

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病患者发生心力衰竭和死亡的重要原因。过度自噬导致心肌受损，可能是DCM的发生发展机制之一。Nrf2除对抗氧化损伤，还可通过负性调控AMPK抑制过度自噬。我们发现：Nrf2在DCM小鼠心肌细胞中低表达、自噬溶酶体增加，增加Nrf2表达可改善心肌功能。由此提出科学假说：过度自噬是DCM心肌损伤的重要因素，增加Nrf2活性可通过抑制AMPK-ULK1-Beclin1通路降低过度自噬，是阻断DCM心肌损伤的途径之一。我们拟利用基因敲除小鼠、siRNA转染，在整体和细胞水平：①明确DCM进展过程中的自噬活性和作用；②阐明DCM中Nrf2表达下调，可通过AMPK-ULK1-Beclin1通路激活自噬加重心肌细胞损伤；③以杨梅酮增加Nrf2表达，可抑制过度自噬，减轻心肌损伤。研究结果将明确：增加Nrf2，可通过AMPK抑制过度自噬，减轻DCM心肌损伤，为DCM防治提供新方向。

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病（DM）主要并发症之一，与 DM 患者心力衰竭（HF）的高发病率和高死亡率密切相关。已知的 DCM 发病机制尚不能完全解释 DCM 的发生发展过程。我们利用野生型C57BL/6J雄性小鼠，以小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导配合高脂饮食方法构建T2DM模型。主要结果为：.一、.持续6个月的高脂喂养构建DCM模型，并设立了对照组。分别在DCM小鼠模型建成后0周、4周、8周、16周、20周、24周以及28周观察自噬、心肌细胞凋亡、纤维化及血糖水平、心功能参数等。细胞水平上：使用H9c2心肌细胞株，设立高糖组（葡萄糖浓度为33mmol/L）及对照组（葡萄糖浓度为5.5mmol/L），分别在高糖培养基和低糖培养基培养后的0h、3h、6h、12h、24h、48h，检测自噬、凋亡。心脏超声显示实验组中射血分数（EF）和缩短分数（FS）呈下降、上升，再下降的趋势，实验组中ATG7、Beclin1、LC3II/I、p62蛋白表达与上述心功能参数具有相同趋势。此结果提示自噬可能与心功能的代偿-失代偿机制相关。.二、.分为正常对照组（CON组）、杨梅酮组（M组）、STZ组和杨梅酮干预组（STZ+M50组及STZ+M100组）。在上述分组中每组随机选取3只腹腔注射氯喹。（1）与CON组、M组相比，STZ组自噬相关蛋白ATG5、ATG7、Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62升高，差异具有统计意义（P＜0.05）；（2）在CON组、M组、STZ+M50组、STZ+M100组中使用氯喹组相较于未使用氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；在STZ组中，使用氯喹组相较于未使用氯喹组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ虽有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；（3）透射电子显微镜示，CON组、M组以及STZ+M组中的肌原纤维、线粒体排列整齐，肌节规则且连续，自噬溶酶体多见，相对比自噬小体较少。STZ组小鼠心肌细胞中线粒体排列紊乱、部分线粒体肿胀、变形，自噬小体丰富，自噬溶酶体相对较少。本项目（1）明确了DCM进展过程中的自噬的动态变化；（2）Nrf2过度激活诱导的氧化还原损伤可能是DCM心肌损伤的重要机制；（3）以杨梅酮可通过调控自噬，减轻心肌损伤。