MYB家族转录因子对大豆异黄酮合成关键基因的协同调控

大豆异黄酮是理想的天然抗癌抗心脑血管疾病的保健品，但栽培大豆中异黄酮含量普遍低于有效浓度，提高含量已成为加大推广利用异黄酮的当务之急。.因种质资源所限、加之受多基因控制，常规育种提高异黄酮含量十分困难。当前主要采用基因工程策略提高其含量，但面临增效不显著或虽有明显增加但农艺性状严重劣变的难题，这已成为目前该项研究的主要难点和攻克目标。.我们利用microarray技术，首次发现CHS8和IFS2基因同时高丰度表达、CHS8/IFS2比值低于1.1倍是提高异黄酮含量且维持农艺性状的关键；转录因子激活CHS8和IFS2比35S启动子直接驱动该两个基因更加高效，由此鉴定出CHS8的高效激活子GmMYB176。本研究试图鉴定出另一关键基因IFS2的激活子，利用协同表达载体控制两个激活子按比例表达，从而既激活CHS8和IFS2高效表达又维持两者间的比例关系，创造出高异黄酮且农艺性状优良的新种质。

大豆异黄酮受多基因控制，采用传统育种方法提高大豆异黄酮含量比较困难。本实验室之前的研究表明，CHS8基因在异黄酮生物合成过程中发挥着重要作用，但CHS8基因过量表达并不能显著提高异黄酮含量。本研究利用Microarray技术，检测了高异黄酮品种RCAT Angra (RCAT)和低异黄酮品种Harovinton (HVNT)的18 362基因在种子发育过程中表达水平的变化以及大豆种子中异黄酮累积的趋势，利用RT-PCR证实CHS8和IFS2分别是CHSs和IFSs基因家族中的主要基因；证实CHS8是类苯基丙醇主路径中的主基因，并发现异黄酮支路中的IFS2基因在RCAT和HVNT品种中表达差异亦达到显著水平。进一步利用发根农杆菌转化系统，在大豆上分别过量表达CHS8、IFS2和CHS8+IFS2，前两者异黄酮含量较对照分别提高65.9%和34.4%，但增幅未达显著水平；而后者则提高了82.3%，增幅达显著水平(P<0.0001)，因而证实大豆中异黄酮的积累由CHS8和IFS2基因共同决定。. 由于植物耐逆性与异黄酮含量具有一定的相关性，基于DGEP技术对野生大豆（高异黄酮）和栽培大豆（低异黄酮）的盐胁迫下的表达分析，揭示了部分转录因子具备目标功能；除此之外，涉及的转录因子还包括bZIP、NAC和WRKY家族。因此，后续研究着重对MYB39和NAC8进行了研究。利用RT-PCR技术克隆了GmMYB39和GmNAC8基因。研究了GmMYB39和GmNAC8基在大豆不同组织中的表达情况进行了检测，结果显示GmMYB39在大豆茎的后期﹑叶和花中均有表达，但在叶的后期表达量极低，而在花中的表达量极高；GmNAC8在所有被检测的组织中均有表达。在三叶期，开花期，结荚期的根和叶中表达量相对比较低，而在各个时期的茎中的表达量都较高。过表达GmMYB39降低了异黄酮合成途径PAL、C4H 、CHS8、4CL 、CHR关键酶基因的表达，并减少了异黄酮的含量，过表达GmNAC8增加了IFS2基因的表达。酵母单杂交实验显示可以与IFS2基因启动子区域中的“CTAG”核心位点结合。