MicroRNA-106a通过p53信号网络调节细胞自噬及肺腺癌骨转移的机制研究

Lung cancer bone metastasis is one of the most serious complications of lung cancer patients. To elucidate the pathogenesis of lung cancer bone metastasis is an urgent need for medical research. A miRNA HiSeq high-throughput sequencing by our laboratory showed that miR-106a was over-expressed in lung adenocarcinoma patients with bone metastasis. Database prediction shows that miR-106a targets a series of genes in p53 network, involving p53 posttranslational modification, protein stability, transactivation activity. Given that p53 has been demonstrated a key gene regulating autophagy, we intend to study whether miR-106a can regulate p53 network and further reveal the direct targets of miR-106a by candidate target genes expression analysis as well as 3'-UTRs and their mutants reporter genes assay. We next intend to investigate whether miR-106a-triggered autophagy reduction is dependent on p53 network using p53 knockout lung adenocarcinoma cell lines (produced by TALEN) and other materials and methods. Fanally, we wonder whether miR-106a functions in lung adenocarcinoma bone metastasis in vitro and in vivo, and further study whether miR-106a-triggered bone matastasis is dependent on autophagy using autophagy-defective mice and autophagy inducers.

骨转移是肺癌患者最严重的并发症之一，阐明肺癌骨转移的发病机制是当前研究的迫切需要。本实验室一项microRNA高通量分析结果显示，miR-106a在肺腺癌骨转移患者中显著上调，进一步实验证实miR-106a可抑制肺腺癌细胞自噬。数据库预测显示miR-106a可靶向p53网络的多个基因，涉及p53翻译后修饰、蛋白稳定性、转录激活等多个环节。已知p53与自噬密切相关，本项目拟研究miR-106a是否调节p53信号网络，通过对候选靶基因的表达分析、3'-UTR及突变体的报告基因分析，确定miR-106a调节p53网络的直接靶点。利用TALEN技术构建p53敲除的肺腺癌细胞系，结合其他方法研究miR-106a调节肺腺癌细胞自噬是否依赖于p53网络。最后，在细胞和动物水平上明确miR-106a是否调控肺腺癌骨转移，并利用自噬缺陷鼠和自噬激活剂研究miR-106a调节肺腺癌骨转移是否依赖于细胞自噬。

肺癌骨转移是肺癌患者最严重的并发症之一，阐明肺癌骨转移的发病机制是医学研究的迫切需要。本项目 microRNA 高通量结果显示，miR-106a 在肺腺癌骨转移患者中显著上调，进一步研究发现miR-106a能够促进细胞应对外部刺激诱导的自噬，应对细胞死亡。但miR-106a参与自噬的分子机制尚不清楚。我们随后通过生物信息学发现miR-106a可能靶向p53网络的多个相关基因，涉及 p53 翻译后修饰、蛋白稳定性、转录激活等多个环节。因此，我们在本项目以miR-106a/p53网络调控自噬为切入点，通过体外细胞功能实验、体内动物模型、临床样本，采用qRT-PCR，免疫组化，双荧光素酶报告实验、蛋白组学等方法，阐明miR-106a/p53网络调控自噬影响肺腺癌骨转移的分子机制。1，肺癌骨转移患者样本中miR-106a、p53及自噬标志物变化：首先在临床样本中发现miR-106a在肺腺癌骨转移的样本中呈显著高表达；进一步研究发现p53在miR-106a高表达组中，阳性表达率明显降低，且自噬标志物LC3表达明显升高。提示miR-106a可能通过p53和自噬通路，参与了肺腺癌骨转移的调控。2，通过体内外实验发现： miR-106a影响肺腺癌肿瘤生长，可能与p53和自噬相关。随后在细胞和动物水平明确miR-106a能够促进肿瘤的生长，抑制细胞凋亡；进一步验证了miR-106a能够调控跟自噬相关的LC3和p53表达。3，确认了miR-106a能够促进肺腺癌细胞迁移和增殖，自噬抑制或缺陷后，miR-106a的促进作用受到抑制。提示miR-106a调控肺腺癌骨转移的作用，需自噬参与。4，在细胞水平明确miR-106a对自噬的调控作用依赖于p53，涉及到p53/AMPK/mTOR信号通路参与。5，进一步确认了miR-106a调控p53机制，其可能通过抑制p53的磷酸化，增加p53出核表达，进而加快其被泛素化降解。6，最后发现miR-106a可能调控p53的两个靶标——MDM4和SIRT7；通过双荧光素酶报告实验、siRNA回补实验明确了miR-106a通过靶向调节SIRT7和MDM4，进而参与p53对于自噬及肺腺癌骨转移调控。综上所述，miR-106a与肺腺癌骨转移密切相关，分子机制涉及到p53介导的自噬通路，其有望为确立自噬作为抗骨转移治疗提供更充分的科学依据和治疗靶点。