以细菌为投递介质诱导昆虫RNA干涉研究

本项目研究棉铃虫通过取食表达双链RNA 的细菌诱导RNA 干涉现象，以RNA.干涉技术为原理，细菌为双链RNA 投递介质，探讨创制以基因为靶标的生物杀虫剂的可能.性。研究中将克隆10-15个在棉铃虫幼虫肠道细胞表达的生命活动重要基因，通过微量注射法分析这些基因片段的双链RNA对棉铃虫幼虫的RNA 干涉活性，观察其表型变化，从中选出RNA 干涉活性较高、有致死表型的基因片段，再通过饲料感染法测定对棉铃虫幼虫的口服RNA干涉活性，选出的基因片段用于构建表达双链RNA的质粒载体，并转化细菌，进一步测定转化后细菌对棉铃虫幼虫的杀虫活性。为建立以RNA干涉为原理、以基因为靶标的生物杀虫剂开创一条全新的道路，筛选出1-2 个有潜在杀虫活性的棉铃虫dsRNA，并建立以基因为靶标的杀虫剂生物测定技术，为建立创制该类生物杀虫剂的技术平台提供技术积累与理论指导。

昆虫肠道中具丰富的微生物类群，它们在昆虫的食物消化、防御、代谢合成等生物过程中起重要作用。本研究通过对鳞翅目幼虫肠道菌的分析，探索利用肠道细菌通过RNA干扰效应防治害虫的可能性。从棉铃虫、甜菜夜蛾、稻纵卷叶螟以及菜青虫幼虫肠道中共得到107个分离物，经16S RNA序列分析鉴定出肠道细菌47种，发现许多细菌种类，如微球菌、克雷伯菌、肺炎克雷伯菌为这4种昆虫所共有，芽孢杆菌、假单胞菌与葡萄球菌在其中3种昆虫肠道中都能分离到，这4种鳞翅目昆虫虽然生活环境与取食寄主完全不同其幼虫肠道菌类群却表现出显著的相似性，也有不少细菌种类在昆虫肠道中的分布具有种的特异性，还首次在昆虫肠道中发现蒂莫内马赛菌和动性球菌。.克隆了棉铃虫与甜菜夜蛾幼虫期表达的功能基因10余个，如vATPase、VHA、coatmer、mov、EcR、USP、actin、E74、JHE、HR3、ftz-f1等，克隆得到了棉铃虫、甜菜夜蛾、二化螟、褐飞虱、白背飞虱与灰飞虱6种昆虫鱼尼丁受体基因的全长序列。定量PCR研究表明转录因子ECR与USP在幼虫体内的表达具同步型，表达出现的峰次也相同，但ECR基因的表达时间稍早于USP的表达，而且ECR与USP在6龄后期的表达量较高，高于其它龄期的表达。转录因子E74、JHE、HR3、ftz-f1的表达也表现出类似的周期性规律。RNA干扰研究表明分别注射ECR或USP的双链RNA或同时注射ECR与USP的双链RNA到幼虫体内使相应的基因明显表达下调，并使幼虫不能正常的蜕皮与化蛹，表现出显著的发育异常表型。ECR dsRNA、USP dsRNA分别注射后，不仅其对应的ECR与USP表达量会下降，同时对其它四个转录因子E74、JHE、HR3、ftz-f1的表达量也有较大的影响，使这些转录因子的表达量同时下降，而注射ftz-f1-dsRNA却对ECR与USP的表达量没有明显影响，说明转录因子ftz-f1位于ECR、USP基因信号转导级联的下游。.研究了假单胞菌和肠杆菌质粒电转化的技术条件与方法，通过电转化技术得到了表达EcR、vATPase等基因dsRNA的阳性转化菌，测定了幼虫取食阳性转化肠道菌后幼虫的表型变化与RNA干扰效应，建立了这些转化菌的生物测定技术。.