酿酒酵母中过氧化物酶体前体形成机制的研究

Peroxisomes are ubiquitous multifunctional organelles that are present in almost all eukaryotic cells. Peroxisomal dysfunction in humans due to deficiency in peroxisome formation results in several inherited diseases, for example some neurodegenerative diseases, and peroxisome biogenesis disorders, etc. However, for decades the mechanism for peroxisome formation is debated largely. Our previous work revealed that pre-peroxisomal vesicles are present in S. cerevisiae ∆pex3 cells, but the underlined mechanism is still unclear. The elucidation of the mechanism for formation of pre-peroxisomal vesicles will be helpful for solving the controversy about different peroxisome formation models, and provides fundamental basis for treating these neurodegenerative diseases in future. In this proposal, we will use yeast synthetic genetic array, combining with whole-genome high-throughput imaging screening, and biochemical separation of pre-peroxisomal vesicles to look for genes involved in formation of pre-peroxisomal vesicles in S. cerevisiae. Subsequently, we will reveal the formation mechanism of pre-peroxisomal vesicles by analysis of the functions of these excavated genes, protein interaction analysis, and genetic interaction analysis. Finally, the real-time analysis of live cell fluorescence will be used to trace the process of pre-peroxisomal vesicles formation, in order to reveal the origin of pre-peroxisomal vesicles in S. cerevisiae cells.

过氧化物酶体是一种广泛存在于真核生物中具有多种代谢功能的亚细胞器。过氧化物酶体形成缺陷导致的功能障碍会引起一些严重的遗传疾病如神经退行性疾病、过氧化物酶体生物发生缺陷病等。然而，对于过氧化物酶体的形成机制学术界一直存在非常大的争议。我们前期的工作发现了酿酒酵母∆pex3细胞存在过氧化物酶体前体,但是其形成机制尚不清楚。因此,研究过氧化物酶体前体的形成机制将进一步完善过氧化物酶体的形成学说，为治疗这些神经退行性疾病提供必要的理论基础。本项目拟通过合成遗传矩阵技术，结合前沿的全基因组高通量成像筛选方法，以及对过氧化物酶体前体进行生化分离，挖掘出参与过氧化物酶体前体形成的相关基因， 随后通过对挖掘出来的基因进行功能分析，蛋白质相互作用分析，遗传互作分析等揭示酿酒酵母过氧化物酶体前体的形成机制，最后通过活细胞荧光实时分析追踪过氧化物酶体前体的形成过程，探索酿酒酵母中过氧化物酶体前体的来源。

倍半萜代谢产物的产生通过甲羟戊酸（MVA）途径合成，被广泛用于医药、食品、化妆品中。丙酮酸作为甲羟戊酸（MVA）途径合成中关键中间体乙酰辅酶A的前体，它的产量直接影响着萜类的合成。为了增加酵母中的萜类化合物产量，我们通采用常压室温等离子体突变筛选了一株高产丙酮酸的酵母菌株，该菌株能在含160 g/L NaCl的YPD培养基中生长良好。于出发菌株相比，突变株A4积累丙酮酸的量提高了50.98%。通过在该酵母中过量表达甘油代谢中甘油激酶（GUT1 和GUT2），甘油脱氢酶（GCY1）, 二羟基丙酮激酶（DAK1和DAK2），和敲除二酰基甘油酰基转移酶（DGA2）来增强甘油的分解代谢, 敲除3-磷酸甘油脱氢酶（GPD2）和过量表达POS5（NADH激酶）来减少甘油的合成代谢，获得一株高产丙酮酸的酵母重组菌。以甘油为底物在发酵96h后，发酵液中丙酮酸含量达到 99.7 g/L。. 倍半萜在酵母中的表达往往会诱发活性氧（ROS），从而导致细胞死亡。橙花叔醇是香精油中的芳香倍半萜，被广泛用于化妆品和肥皂中。人类抗凋亡蛋白Bcl-2可以保护某些酵母突变体免受氧化损伤引起的细胞死亡。我们发现在具有增强的甲羟戊酸途径的工程酵母中过量表达Bcl-2可以使得橙花叔醇的产量提高77.7％，达到594.1 mg/L。 BCL-2的过表达还增加了细胞活力并降低了ROS水平。转录组分析表明，BCL-2的过表达与HAC1调控机制相同，它们共同调节单羧酸，脂肪酸和细胞氨基酸的代谢过程。 这些结果表明，由BCL-2过表达引起的多种途径的代谢调节可能与UPR有关，并导致了橙花叔醇合成的改善。 当将不饱和脂肪酸添加到培养基中后，橙花叔醇产量进一步提高到725.5 mg/L。这项研究为酵母中倍半萜的生产提供了有效而简单的策略。