中性粒细胞弹性蛋白酶对非酒精性脂肪性肝炎小鼠肠道通透性的影响和调控机制

There is a growing body of evidence suggesting that increased intestinal permeability is closely associated with nonalcoholic steatohepatitis (NASH). We hypothesized that neutrophil derived elastase (NE) play a central role in the pathogenesis of NASH during gut-liver crosstalk via regulating the gut permeability, however, the mechanism is still unclear. So, firstly, our study is designed to confirm the key function of intestinal hyperpermeability in NASH using several reliable rodent models. Secondly, we will investigate the crucial role of NE in gut permeability regulatory by loss of gene function (NE-/-), overexpression of NE (recombinant NE), specific loss/recovery of gene function (Chimerism of bone marrow-derived cells). Lastly, we will clarify the regulatory mechanism by separating mice neutrophils and culturing intestinal epithelial cells, combining with NE inhibitor intervention, specific SiRNA interference, and recombinant protein co-incubation. In summary, we will delineate the role and its mechanism of NE in progression of NASH by regulating gut permeability to provide precise target for NASH prevention.

肠道通透性增加与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的发生发展关系密切。我们前期研究表明中性粒细胞来源的弹性蛋白酶（NE）作为“肠-肝对话”的核心分子介导NASH的发生和发展，但具体的作用机制不清楚。本研究首先在多种动物模型中证实肠道通透性增加是NASH发生的始动因素；其次应用基因功能缺失、过表达、组织特异性缺失/恢复（NE骨髓源性细胞嵌合体）等多种方法探讨NE对NASH小鼠肠道通透性的影响；最后应用分离的中性粒细胞和体外培养的肠上皮细胞，结合NE抑制剂干预，SiRNA干扰以及基因重组蛋白共培养等技术阐明NE调控肠道通透性的分子机制，为NASH精准防治提供确切靶点。

非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis, NASH）是一种肝内脂肪过度积聚导致的慢性进展性肝病，NASH作为一个典型的生活方式疾病，肠-肝轴是当前的一个研究热点。临床和实验研究均表明，肠道菌群失调是NASH发生的一个重要因素。本研究首先分别以高脂高胆固醇饮食(High fat and high cholesterol diet, HFHC)饮食诱导ApoE-/-小鼠，MCD饮食诱导C57BL/6J小鼠建立NASH小鼠模型，体内动态观察NASH 小鼠肠道通透性的变化，结合终点血清学和组织学炎症指标等综合观察 NASH和小鼠的肠道通透性的相关性。其次在APOE-/-及C57/B6小鼠中敲除NE基因，并以高脂高胆固醇饮食 (High fat and high cholesterol diet, HFHC) 进行诱导建立NASH小鼠模型，明确NE 通过影响肠道通透性从而促进小鼠NASH 发生发展。最后体内试验观察NE抑制剂干预的小鼠肠道中紧密连接蛋白和MLCK依赖性通路相关蛋白的表达；结合体外实验：以rNE酶作用于基因重组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin，结合应用NE特异性抑制剂Sivelestat，探究NE通过降解紧密连接蛋白调控肠道通透性的机制。最后得出结论，肠道菌群失调，肠源性内毒素增加，肠道通透性增加，是NASH的始动因素。而NE-KO不仅能降低小鼠肠道通透性，影响肠道紧密连接蛋白的表达，还能减轻肝脏炎症，中性粒细胞来源的NE 作为肠-肝对话的核心分子介导NASH 的发生和发展，以MLCK 依赖性和非MLCK 依赖性机制介导肠道通透性增加，肠源性内毒素通过门脉系统直接进入肝脏，促使炎症细胞在肝内募集触发肝脏炎症反应，从而促进NASH 发生发展。