内/外源性肽类激素结构鉴定和定量傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICRMS)方法的探索研究

内/外源促红细胞生成素(EPO/rhEPO)，人生长激素(hGH/rhGH)检测涉及内/外源蛋白质结构相似或相同，蛋白质修饰糖基结构鉴定难，亚型种类多，基体中目标物含量低，定量结果可比性较差等难题。FT-ICR-MS具有高分辨率、高灵敏度、宽的质量范围，具有多重独特的裂解技术，优于常规的质谱裂解技术，可以鉴定翻译后修饰位置及修饰结构，实现混合物中目标物的准确检测，且具有很好的定量优势。本项目拟将FT-ICR-MS应用于内源EPO和重组rhEPO的结构鉴定，通过较简单的前处理获取更全面的修饰位点结构信息；建立血样基体中hGH FT-ICR-MS同位素稀释定量测量程序，并在此基础上开发滥用rhEPO、rhGH检测方法。FT-ICR-MS方法将更准确、有效、简单的实现肽类激素的定性定量分析，这不仅在肽类兴奋剂滥用检测中有良好的应用前景，也将在临床低含量蛋白质基体样品的准确检测中有很高的实用价值。

重组人促红细胞生成素(rhEPO)是典型的肽类激素兴奋剂，它的检测是一项非常艰巨的工作，竞技体育中，rhEPO的滥用主要是通过糖基结构鉴定来区分内外源人促红细胞生成素。傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（FT-ICRMS）具有高分辨率，高灵敏度，宽的质量范围，多重独特的裂解技术，可以鉴定蛋白质翻译后修饰位置及修饰结构，在肽类兴奋剂滥用检测中有良好的应用前景。.重组人促红细胞生成素 (rhEPO)是一种具有典型代表性的糖蛋白，含有三个N-连接糖基化位点和一个O-连接糖基化位点。本研究采用蛋白酶Glu-C有效的酶解了EPO-a样品，利用液相色谱-线性离子阱质谱法鉴定了EPO-a样品酶解后的多肽片段和糖肽片段，通过碰撞活化解离（CAD）分析，推导出O-连接糖肽糖链的结构。对N-连接糖肽也进行了探索性研究。同时采用傅立叶变换离子回旋共振质谱法(FT-ICRMS)，利用CAD技术和电子捕获解离(ECD)技术的互补性，进一步分析了 rhEPO-α中O-连接糖基化位点及糖基化结构，成功鉴定了O-连接糖基化结构，并对O-连接糖肽的两种不同价态的ECD断裂方式做了进一步的探讨分析，同时对N-连接糖基化结构进行了初步分析。本研究工作为EPO的检测鉴定提供了一种简单快速的检测方法，同时为糖蛋白中O-连接糖基化位点的研究提供了一种新方法，为开发准确可靠的肽类兴奋剂rhEPO基体检测方法奠定了基础。