内质网ATP酶torsinA与其相互作用蛋白结合的结构基础

TorsinA is a novel ATPase localized within the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). A deletion of one of a pair of glutamate residues (E302/303) near the carboxyl-terminus of torsinA causes most cases of early-onset primary torsion dystonia (EOPTD). EOPTD is an inherited neurological movement disorder that causes the muscles to contract involuntarily，forcing the body of patients into repetitive movements and often twisted postures. Homologous sequence analysis reveals that torsinA is a member of AAA+ ATPase superfamily of proteins (the ATPases associated with a variety of cellular activities), which have a variety of cellular locations and functions. Description of the structure and the function of torsinA is the most basic step in elaborating a molecular mechanism of EOPTD which can be exploited for therapeutic benefit. Utilizing X-ray crystallography and NMR, we are planning to solve the structure of torsinA and its interacting proteins, study the conformational changes of the interaction between them. In addition, we are going to investigate the physiological functions of torsinA and its interacting proteins, especially their roles in cell migration in various neurons, and the dysfunction of the known dystonia-causing mutations, for better understanding the molecular pathology of EOPTD.

TorsinA是位于细胞内质网腔的一种ATP酶，其C端一个谷氨酸残基的缺失会导致早发型全身性肌张力障碍（early-onset primary torsion dystonia，EOPTD）。这是一种可遗传的神经性运动障碍，患者因身体肌肉的持续收缩而无法随意活动。根据同源性分析，torsinA属于AAA+蛋白超家族，通过水解ATP产生的能量使其底物发生构象变化，参与细胞内多种重要过程，已发现几种与其发生相互作用的蛋白质，但作用机制不详。本研究计划运用X-射线晶体学结合核磁共振波谱学解析torsinA与其相互作用蛋白质的结构，并研究二者结合引起的构象变化；运用生物化学和细胞生物学方法验证torsinA与不同底物蛋白质的相互作用，特别是它们在细胞迁移中的作用，分析突变体的影响。期望在分子水平上阐述torsinA发挥功能的结构基础，为认识EOPTD的致病机理和发展有效治疗方法提供理论依据。

遗传性早发型肌张力障碍（early-onset primary torsion dystonia, EOPTD）是一种神经性运动障碍，患者因身体肌肉的持续收缩而无法随意活动。与此运动障碍密切相关的DYT1基因，其蛋白质产物torsinA的C端一个谷氨酸残基的缺失就会引起这种显性遗传病。TorsinA是位于细胞内质网腔的一种ATP酶，它属于AAA+蛋白超家族，通过水解ATP产生的能量使其底物发生构象变化，参与细胞内多种重要过程。研究已发现多种与torsinA发生相互作用的蛋白质，但是有关torsinA与之作用的结构基础仍然不清楚。我们尝试了在大肠杆菌中表达和纯化torsinA来自线虫的同源蛋白OOC-5，进行蛋白质结晶的筛选和优化；由于得到的晶体较小、排列不好，X-射线衍射数据不能用于精细结构的解析。我们也在大肠杆菌中表达和纯化了torsinA的C端带有疾病突变体的片段，并得到了15N标记的二维谱图；由于蛋白表达量、纯化和标记等问题，仍然没有解析出这一结构域的结构。结构解析未完成，影响了torsinA与其相互作用蛋白结合的构象变化研究。利用偶联酶和显色法，我们初步研究了OOC-5的ATP酶活性，及各种因素对酶活性的影响。运用生物化学和细胞生物学方法验证了torsinA与底物LAP1和LULL1的相互作用；有关torsinA及底物在细胞迁移中的作用，仍需优化实验方法进行深入研究。这些初步探索，为最终解析torsinA蛋白家族的结构，进一步研究其功能和作用机制提供了线索。.经过项目研究内容的调整，我们解析了细胞迁移相关肌球蛋白Myosin9b的GAP结构域的晶体结构，发现Myosin9b的GAP结构域具有一个特殊的区域patch II（特别是R1742和R1744这两个带正电荷的精氨酸），在特异性识别和失活RhoA时起到关键作用。我们的研究还发现，Myosin9b在肺癌细胞中高表达，因此结构研究将有助于进一步理解SLIT/ROBO/Myo9b/RhoA信号通路在细胞迁移中的作用，为肺癌的诊断和治疗提供重要的研究思路。