移虫时间对西方蜜蜂蜂王生殖发育的影响及分子机理的研究

Improving reproductive performance is an important goal of honeybee breeding, and reproductive development of the queen is greatly affected by the age of transferring larvae. In this study, ovaries morphology, JH and Ecd of 4th instars transferring in 0h, 24h, 48h, 72h are detected, and the reproductive performance of queens developed from different transferring age are monitored. The transcriptomes of 4 days old larvaes with different transferring age are analyzed using RNA-Seq method, and effective genes and regulatory pathways effected reproductive development of queen are screened through GO and Pathway enrichment analysis. The whole genome DNA methylation level of 4 days old larvaes with different transferring age are analyzed using bisulfite sequencing method, the enigenetic mechanism for reproductive development of queen are surveyed through differential methylation regional analysis. The data of transcriptome and genome-wide methylation are integrated, and the reproductive performance analysis of 4th instars and queens developed from different transferring age is taken into account to screened for effective genes and regulatory pathways. RT-PCR and western blot technology is used to validate the the genes effected reproductive development of queen and the regulatory network. This study provide theoretical basis for guiding the bee breeding work, and provide new research data and theoretical basis to enrich the study on honey bee caste determination.

繁殖性能是蜂王育种工作中关注的重点，移虫时间对蜂王生殖发育影响显著。本研究对孵化后0h、24h、48h、72h移虫至王台内发育的4日龄幼虫卵巢形态、保幼激素及蜕皮激素进行检测，并对各组出房蜂王进行繁殖性能测定。利用RNA-Seq技术对各组4日龄幼虫卵巢组织进行转录组差异表达分析，对差异表达基因进行GO功能及Pathway显著富集分析，探究影响蜂王幼虫早期生殖发育的功能基因及生物学通路。运用Bisulfite-seq 技术对各组4日龄幼虫卵巢组织全基因组5mC信息扫描和差异性甲基化区域分析，探明影响蜂王幼虫早期生殖发育的表观遗传学机制。整合卵巢组织转录组及全基因组甲基化数据，结合各组蜂王繁殖性能分析，运用RT-PCR及western blot 技术验证，筛选调控蜂王生殖发育的关键基因及调控网络。本研究为指导蜜蜂育种工作提供理论基础，同时为丰富和完善蜜蜂级型分化研究提供新的数据和理论依据。

蜜蜂的繁殖分工基于级型分化，蜂王和工蜂遗传物质相同，但在繁殖性能上却完全不同，环境和食物是影响卵及幼虫发育的关键因素。3日龄内工蜂幼虫被移到人工王台内后能发育成有成熟卵巢的蜂王，但移虫时间越晚，蜂王的质量越低，尤其繁殖性能受影响越大，这一现象对于研究蜂王的发育及雌性蜜蜂的级型分化是极好的素材。本研究对孵化后24h、48h、72h（工蜂幼虫）移虫至王台内发育的4日龄幼虫保幼激素及9日龄幼虫蜕皮激素进行检测，并对各组出房蜂王进行繁殖性能测定。结果表明不同移虫日龄所培育的蜂王幼虫4日龄JHⅢ和9日龄Ecd滴度均随着移虫日龄的增加而显著下降。对不同移虫日龄下的处女王繁殖性状进行了测定，结果表明随着移虫日龄的增加，蜂王的初生重和头重显著减轻，蜂王的卵巢重及卵巢管数显著减小。对蜂王卵巢组织iTRAQ定量分析表明不同组间细胞代谢、分裂以及蛋白质合成方面存在显著差异。说明移虫日龄对蜂王生殖发育产生了显著影响。利用RNA-Seq技术对各组4日龄幼虫进行转录组差异表达分析，结果发现，不同移虫日龄下95个通路发生了变化，其中52个通路与合成及代谢相关，16个与遗传信息进程相关，12个与细胞组分相关，2个与人类疾病相关，而有13个与胚胎发育密切相关。运用Bisulfite-seq 技术对各组4日龄幼虫组织全基因组5mC信息扫描和差异性甲基化区域分析，甲基化水平差异基因富集在40个通路中，主要集中在蜜蜂级型分化及发育相关通路中。将蛋白质组、全转录组及全基因组甲基化数据进行整合联系分析，我们发现，受移虫日龄的影响，工蜂幼虫在被移植到人工王台后，遗传信息的表达发生了巨大的改变。其中，MAPK, FoxO, mTOR, Wnt, TGF-beta Hedgehog Toll and Imd, 和 Hippo等生物通路通过相互大量的“通话”，相互协同，共同改变了工蜂幼虫的发育途径。Casein kinase 1，Transcriptional regulator Myc-B 及 S-phase kinase-associated protein 2基因在这些生物通路的通话中起着重要的联络作用。本研究为探明蜜蜂生殖发育的分子机制提供了有效信息，同时丰富了蜜蜂级型分化的分子机理。