基于桃柘酚分子探针研究桃柘酚对缺血性脑卒中的神经保护作用及作用靶标

Ischemic stroke has become one of the serious diseases threatening the health of human being. Medications used for the treatment of ischemic stroke has been made some progress, but due to the complicated pathophysiologic mechanisms of ischemic stroke disease, searching for novel neuroprotective drugs would be a trend for the drug development on ischemic stroke. Using the established in vitro model on glutamate-induced primary neuronal injury, which is closely associated with pathologic process of ischemic stroke, to randomly screen a compound library, we obtained a small-molecule natural product totarol. Totarol has been reported to have anti-microbial activity, but its neuroprotective role has not been reported so far. This project will focus on study of the neuroprotective role of totarol in in vitro neuronal injury models and in in vivo rat ischemic stroke model, and its molecular mechanisms. Based on preliminary structure-activity relationship study, using the activity-based protein profiling (ABPP) method combined with photoaffinity labeling and click chemistry, we will design and synthesize totarol’s ABPP probe, and use it to label target proteins. With this molecular probe of totarol, we will discover the possible protein target directly interacting with totarol, which will provide a new drug target for the neuroprotective drug development, and elucidate a specific molecular mechanism of totarol neuroprotection, which will provide a preclinical experimental basis and theoretical basis for the totarol development into a neuroprotective drug.

缺血性脑卒中是严重危害人类健康的重大疾病之一。缺血性脑卒中的药物治疗已取得了一定的进展，但由于其病理生理机制复杂，所以寻找新的神经保护药物仍是目前脑卒中药物开发研究的热点。通过建立与脑缺血病理过程密切相关的谷氨酸诱导的原代神经细胞损伤的体外模型，随机筛选化合物库，我们得到一个小分子天然产物桃柘酚。桃柘酚具有很好的抗菌活性，但其神经保护活性未见报道。本项目将主要研究桃柘酚在体外神经细胞损伤模型和在体内大鼠局灶性脑缺血模型中的神经保护作用；在初步构效关系研究的基础上，应用基于活性的蛋白质谱学（ABPP）研究方法，结合光亲合标记和环加成反应策略，设计并合成桃柘酚的ABPP探针分子。应用桃柘酚探针分子的标记实验，一方面将发现桃柘酚的作用靶点，为神经保护药物的开发提供新的药物靶标；另一方面阐明桃柘酚神经保护作用的具体分子机制，为桃柘酚类衍生物开发成为新型的神经保护药物提供临床前的实验依据和理论基础。

缺血性脑卒中占脑卒中患者70%以上，是一类脑血管循环障碍性疾病，由于脑的供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄或闭塞、脑供血不足而导致的脑组织坏死，具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点。天然产物桃拓酚是一种从桃拓罗汉松中分离出来的二萜酚类化合物，具有抗疟原虫、抗微生物和抗真菌活性，但其在神经保护方面的功能却未见报道。所以本课题主要探讨了桃拓酚抗缺血性脑卒中的神经保护作用及其相关机制。本课题分别建立了体外和体内模型用以研究桃拓酚的神经保护作用及可能机制。研究内容如下：1）桃拓酚对谷氨酸、氧糖剥夺、营养缺失等引起的神经元损伤的保护作用；2）在SD大鼠的急性脑缺血再灌注（tMCAO）模型中，桃拓酚对脑梗死体积、神经行为学功能的影响；3）桃拓酚对Akt和GSK-3β的磷酸化水平，Nrf2和HO-1的表达，GSH和SOD的活性的影响。结果显示：桃拓酚能显著改善由谷氨酸、缺氧缺糖等引起的神经细胞损伤；桃拓酚通过上调Akt和GSK-3β的磷酸化水平，增加Nrf2和HO-1的表达，增强GSH和SOD的活性而发挥抗氧化活性，在SD大鼠的急性脑缺血再灌注（tMCAO）模型中，桃拓酚可以明显减少缺血导致的脑梗死体积，改善大鼠的神经行为学功能。加入LY294002（PI3K/Akt抑制剂）、ZnPPIX（HO-1抑制剂）后桃拓酚的神经保护作用被逆转，说明桃拓酚可能通过激活Akt/HO-1通路在脑缺血中发挥抗氧化功能从而起到神经保护作用。本课题通过实验证明了桃拓酚通过激活Akt/HO-1通路在脑缺血中发挥抗氧化功能从而起到神经保护作用。本课题研究结果可能为缺血性脑卒中提供新的治疗药物。通过本课题研究工作，已将取得的研究结果申请国内发明专利1项，直接内容发表SCI研究性论文1篇（Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015, 289(2): 142-154.），其他相关内容发表SCI论文14篇，培养研究生3名。