针对绿脓杆菌三型毒性分泌系统关键调控蛋白spuE的抗体开发及机理研究

Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infection, a major source of nosocomial acquired infections, is posing a global threat to mankind. Thus exploration of novel targets against Pseudomonas aeruginosa is very urgent. Pseudomonas aeruginosa type III secretion system (T3SS) can directly inject toxic proteins into host to cause infection and is recognized as a novel drug target. In Pseudomonas aeruginosa, spuE, a polyamine binding protein involved in spermidine binding and transport, is identified as a key regulator of T3SS. Moreover, polyamine in Pseudomonas aeruginosa can induce drug resistance to aminoglycosides and fluoroquinolones. Therefore, targeting spuE to treat Pseudomonas aeruginosa infection and drug resistance may be a novel therapeutic strategy. Nowadays, therapeutic monoclonal antibodies are becoming molecules of choice to treat auto-immune disorders, infectious diseases, and cancer with high safety and efficacy. Global sales of therapeutic monoclonal antibodies are rising rapidly. By our knowledge, there is no report to develop monoclonal antibodies against spuE in treating Pseudomonas aeruginosa infection. In this proposal, we will employ a large human naïve scFv phage library to pan out effective antibody against spuE that can inhibit T3SS activity, reverse antibiotics resistance and lower toxicity in Pseudomonas aeruginosa. Furthermore, protein crystallography and structural biology will be used to address the molecular mechanism of developed antibody with therapeutic potential.

目前多重耐药性绿脓杆菌已成为医院感染的主要源头，因此寻找新型药物靶点十分紧迫。绿脓杆菌III型分泌系统直接将毒性蛋白注射入宿主细胞导致感染，是一个重要的药物靶点。在绿脓杆菌内，负责多胺中亚精胺转运的spuE蛋白是III型分泌系统的关键调控蛋白；同时发现多胺可以诱导绿脓杆菌对氨基糖苷类及喹诺酮类抗生素的抗性。因此靶向spuE或许是一条抗绿脓杆菌感染及耐药的新思路。单克隆抗体在针对自身免疫相关疾病、感染性疾病及癌症的治疗中，具有安全有效的显著特点。据我们所知，目前并未有针对spuE开发单克隆抗体用于绿脓杆菌治疗的尝试报告。本申请书主要运用人天然大型噬菌体scFv抗体展示文库来筛选能够与绿脓杆菌spuE特异结合并干扰多胺转运，具有抑制III型分泌系统活性、减弱绿脓杆菌毒性、并能提高绿脓杆菌抗生素药敏的具有潜在治疗性的抗体。同时运用晶体结构生物学来阐释所筛选出的抗体的分子作用机制。

目前多重耐药性绿脓杆菌已经成为医院感染的主要源头，因此寻找新型药物靶点十分紧迫。绿脓杆菌III型分泌系统直接将毒性蛋白注射入宿主细胞中导致感染，是一个重要的药物靶点。在绿脓杆菌内，负责多胺中亚精胺转运的SpuE蛋白是III型分泌系统的关键调控蛋白；同时发现多胺可以诱导绿脓杆菌对氨基糖苷类及喹诺酮类抗生素的抗性。因此靶向SpuE或许是一条抗绿脓杆菌感染及耐药的新思路。单克隆抗体在针对癌症、免疫相关疾病及感染性疾病等疾病的治疗中，具有安全有效的显著特点。据我们所知，目前并未有针对SpuE开发单克隆抗体用于绿脓杆菌治疗的尝试报告。本申请书主要运用人天然大型噬菌体scFv抗体展示文库来筛选能够与绿脓杆菌SpuE特异结合并干扰多胺转运，具有抑制T3SS活性、减弱绿脓杆菌毒性、并能提高绿脓杆菌抗生素药敏的具有潜在治疗性的抗体片段。同时运用晶体结构生物学来阐释所筛选出的抗体片段的分子作用机制。.按照预期计划，本课题筛选出三株能够与SpuE特异结合的scFv抗体，表位归类实验提示这三株抗体属于一类表位。然后选取其中一株亲和力最高的抗体进行了进一步实验。功能实验提示该株抗体具有减弱多胺结合、抑制T3SS活性并能减弱绿脓杆菌毒性的作用。运用晶体结构生物学，我们解析了其中两株抗体与SpuE及多胺的复合物结构，结构显示这两株抗体结合表位均恰好位于SpuE两个功能域的铰链区域，从结构角度肯定了之前实验提示的三株抗体同结合一类表位的结论。基于晶体三维结构复合物，结合分子模拟实验，提示结合于铰链区的抗体能够干扰两个功能域的正常关合，从而干扰了多胺分子的结合及转运。本课题提示这些抗体具有减弱绿脓杆菌毒性的应用前景，值得进一步开发。