miRNA在香蕉果实成熟启动前期的作用机理研究

香蕉是我国的大宗水果之一，研究其成熟机理对于控制果实成熟，减少采后损失，延长货架期和增加农民收入意义重大。miRNA是近年发现的广泛存在于真核生物体内的小分子RNA，在转录后水平调控靶基因的表达，涉及到生物体的发育、衰老、对胁迫的响应等一切生命进程。本研究以香蕉采收后至成熟启动前这一时期作为研究重点，使用丙烯（乙烯功能类似物）和1-MCP（乙烯功能抑制因子）对香蕉果实进行促进/抑制成熟的处理，研究miRNA在这一成熟关键时期的表达特征，构建出miRNA 在香蕉果实成熟启动前期的差异表达谱，寻找miRNA调控网络的关键节点基因，探寻miRNA和香蕉果实乙烯受体之间的调控互作，以期能揭示miRNA在香蕉果实成熟启动前期的调控作用，从而能更深入的了解香蕉的成熟机制。研究成果对于丰富跃变型果实的成熟理论，指导我国香蕉采后商品化处理，提高其在国际市场上的竞争力，具有重要的理论和现实经济意义。

呼吸跃变果实香蕉对乙烯敏感，极低浓度的乙烯可启动成熟。本项目发现，采后数小时的香蕉乙烯敏感性低，此时期的香蕉经乙烯处理后果实的成熟相关生理指标与对照无异。贮藏后乙烯敏感性提高，乙烯可迅速启动果实成熟。为了解小RNA在香蕉采后由乙烯低敏感期向高敏感期转变中的作用，对这两时期的香蕉果肉进行miRNA高通量测序分析，结果发现13个差异miRNA，其中5个下调，8个上调。再对这两时期乙烯处理后的样品进行测序分析，检测到14个差异表达，6个上调，8个下调。结合miRNA和靶基因的荧光定量验证，推测miR167（靶基因ARF，SBPL），miR172（靶基因AP2A、HOX、EP1、PSS），miR319（靶基因MYB），miR164（靶基因NAC），miRn4（新miRNA,靶基因未知）可能在香蕉果实成熟启动前期发挥作用。对成熟启动后的分析表明，成熟启动至乙烯高峰出现前（1级-3级），有18个差异miRNA，11个上调，7个下调；乙烯高峰出现后至梅花点出现（3级-6级），有31个差异miRNA，14个上调，17个下调。差异关联分析表明，miR169, miR399, miR397, miR399, miR171, miR398, miR172 可能参与了香蕉从成熟度1级向3级的转变。miR394, miR166, miR529, miR156, miR171, miR408, miR172 可能参与了香蕉果实由成熟度3级向6级的转变。研究了miR164的靶基因，NAC转录因子在成熟中的作用，发现MaNAC2的启动子在乙烯处理后激活， MaNAC1/2和下游的乙烯信号分子蛋白MaEIL5(EIN3类蛋白)结合，使其在成熟过程中下调。推测MaNAC 蛋白，如MaNAC1/2有可能通过和乙烯信号元件互作的方式，参与了香蕉果实的成熟进程。采用轻度和重度冷害的香蕉，研究了乙烯信号元件的协同作用。结果表明，轻度冷害的香蕉果实经丙烯处理后正常成熟，而重度冷害的果实成熟转色缓慢。乙烯处理后轻度冷害香蕉果实中MaACS1,MaACO1, MaEIL1, MaEIL2 显著上调， 重度冷害香蕉果实中MaERS3, MaEIL1 , MaEIL4 显著上调。推测miRNA 通过调控转录因子如NAC，转录因子再和乙烯信号元件互做调控果实成熟。