NAC转录因子调控荔枝果柄离区细胞凋亡的机理研究

How to reduce fruit loss is becoming an urgent problem in agricultural production. It has been previously proved that programmed cell death (PCD) process is involved in the separation of abscission zone cells during abscission, and the vacuolar processing enzymes (VPEs) played an important role in PCD process which NAC transcription factors were closely related to. However, the regulation mechanism of PCD process in abscission is still unclear. Our preliminary results have shown that PCD process was involved in litchi fruit abscission. Moreover, the accumulations of four NAC and three VPE genes in abscising fruit abscission zone were apparently higher than that in control group. Hereby we proposed that an important way of PCD process involved in abscission may be through the activation of VPE by NAC transcription factor to induce caspase activity. In this project, we will combine the cytology, molecular biology and biochemistry to analyze the features of PCD, the location, dynamic changes and function of NAC and VPE genes during the fruit abscission in litchi which is a famous special fruit tree in china but having severe fruit drop problem. It will provide new evidence to further explore the regulated mechanism of NAC transcription factoron the PCD process involved in abscission cells.

果实脱落一直是农业生产中一个亟待解决的“瓶颈”问题。细胞程序性死亡（PCD）参与了器官脱落过程中离区细胞的分离过程，但其调控机理不明。研究表明液泡加工酶（VPE）在PCD中起关键调控作用，NAC转录因子与PCD的发生密切相关。我们的前期研究证实荔枝果实脱落过程中存在PCD，并发现即将脱落果中多个NAC和VPE基因的表达显著高于正常果。据此提出NAC转录因子通过调控VPE基因的表达，激活caspase活性，启动PCD进程可能是一条调控器官脱落的重要途径的科学假设。本项目选择我国特产但落果严重的荔枝果树作为研究对象，以NAC转录因子在荔枝幼果脱落过程中离区细胞发生PCD的具体功能和作用为主线，从不同层次和角度进行研究，综合分析离区细胞PCD特征、NAC和VPE基因在脱落过程中的动态变化、定位和功能，以揭示NAC转录因子对离区细胞凋亡的调控和荔枝果实脱落机理，具有重要的理论和应用价值。

器官脱落是农业生产中一个重要的农艺形状，严重的生理落果已成为荔枝产业中亟需解决的关键问题之一。离区是脱落发生的主要部位，离层的形成与分离是研究植物器官脱落的核心内容。近年来已有研究表明细胞程序性死亡（PCD）参与了叶片和花器官的脱落过程，但其调控机制知之甚少，而对于果实来说，如荔枝，PCD是否参与其脱落过程却仍未知。本项目以荔枝果实的脱落部位果柄离区为研究对象，运用细胞学、生理生化和分子生物学等技术阐明液泡介导的PCD参与荔枝幼果脱落过程的机制，主要研究结果如下：（1）通过离区细胞超微结构观察、核形态观测以及TUNEL检测，发现荔枝幼果脱落过程中存在PCD现象，属于主动的并且与液泡破溃密切相关的死亡，随着脱落进程的推进，核DNA断裂程度不断增强，细胞死亡不断扩大。与此同时，与液泡破溃相关的VPE和类caspase-1酶活性显著增强，LcVPE1和LcVPE2基因的表达明显上调。（2）荔枝共有97个荔枝NAC转录因子，其中LcNAC05/13/38/40/65基因在果柄离区中的表达随荔枝幼果脱落的加剧而明显上调，LcNAC10则显著下调。（3）异源转基因结果显示，仅有LcNAC40基因的超表达能够明显促进拟南芥花器官的提前脱落。（4）利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术沉默LcNAC40基因表达后可显著降低荔枝幼果的落果率，且LcVPE1和LcVPE2基因的表达明显受到抑制。（5）LcVPE1/2启动子存在多个NAC结合元件，通过凝胶阻滞分析（EMSA）和双荧光瞬时表达分析实验，证实LcNAC40可以结合并激活LcVPE1/2启动子的活性。以上结果明确了PCD在果实脱落中的存在，初步阐明了NAC转录因子在落果过程中的调控作用，为荔枝高产育种提供了基因资源，也为深入阐明荔枝果实脱落分子机理提供了理论基础。本项目培养博士后1名，研究生1名，部分结果已发表在Journal of Experimental Botany（2019）和Tree Physiology（2019）杂志上。