发芽大豆γ-氨基丁酸富集与调控机理研究

研究低氧胁迫、盐（NaCl）胁迫及其联合处理对发芽大豆不同生长阶段、芽体各部位中γ-氨基丁酸(GABA)含量变化的影响，筛选GABA富集量最高时的氧分压与盐浓度；在此条件下，分别添加抑制GABA支路中关键酶-谷氨酸脱羧酶(GAD)活性、抑制多胺降解途径中关键酶-二胺氧化酶(DAO)活性的试剂，比较发芽大豆中两途径的GABA富集量，经GABA恒算，确定两途径的贡献率；研究低氧胁迫下盐处理时，脱落酸(ABA)抑制剂、Ca2+抑制剂对发芽大豆中GAD和DAO活性、谷氨酸和腐胺降解量及GABA富集量的影响，探明内源ABA、Ca2+对GAD、DAO基因表达水平的差异，从分子水平上揭示发芽大豆GABA富集与调控机理，这将有助于提高逆境胁迫条件下发芽大豆合成GAD和DAO能力和活性，从而提高GABA富集效果。这一研究在国内外未见报道。因此，本课题的开展具有重要的理论意义和应用价值。

本项目采用盐和低氧胁迫研究大豆发芽过程中GABA的富集与调控机理，并对盐胁迫、低氧胁迫及其联合对发芽大豆富集GABA及其不同部位GAD和DAO等基因表达水平差异、ABA对发芽大豆GABA富集及调控机理进行了研究。主要研究结果如下：.1、大豆在30℃黑暗条件下发芽5 d，是大豆发芽富集GABA的适宜条件。低氧下，大豆发芽富集GABA的最优发芽条件为：培养温度30.5℃、培养液pH 4.13、通气量0.91 L/min，此条件下GABA富集量达到2.65 mg/g DW，为原料的16.6倍；盐胁迫下，大豆发芽富集GABA的最优条件是：NaCl浓度为133.5 mM、发芽时间5.5 d、发芽温度33.3℃，在此条件GABA含量为原料的13.5倍。.2、低氧胁迫下，大豆胚中GABA富集量中有32%因多胺降解途径中DAO活力升高形成的。低氧胁迫下，谷氨酸、磷酸吡哆醛、精氨酸、CuCl2、NaCl和CaCl2处理的GABA富集量分别为4.07、3.02、3.50、3.26、4.00和 3.30 mg/g DW，均显著高于正常发芽(CK)和低氧胁迫处理（CK0）。.3、低氧联合盐胁迫下，富集GABA的两条途径均被加强，发芽大豆子叶和胚中GABA含量是单纯低氧胁迫的1.47和2.00倍。在此基础上添加CaCl2，子叶和胚中GAD活力是单纯低氧胁迫的1.80和2.26倍。低氧联合盐胁迫下加入EGTA后，发芽大豆中Ca2+被螯合，GAD活力降低，发芽大豆的胚中Glu积累。.4、低氧联合盐胁迫下添加AG，发芽大豆子叶和胚中GAD基因表达量分别增加了53.76%和173%，CaM表达也发生相应变化。低氧联合盐胁迫下添加Ca2+后，子叶和胚中GAD表达量分别比未添加者增强0.54和2.98倍。Ca2+通过与CaM结合，形成钙调素，促进发芽大豆中GAD表达，增加发芽大豆GABA富集量。.5、低氧联合盐胁迫下，外源ABA处理使发芽大豆内源ABA和Ca2+含量升高，氟草酮则使内源ABA和Ca2+含量和GAD活力显著降低，并引起Glu的积累。与对照相比，ABA处理后发芽大豆GAD基因表达量差异不显著；Flu处理提高了GAD基因的表达。低氧联合盐胁迫下加入ABA后，胚根中部DAO表达量下调，其它部位变化无显著差异。Flu处理促进了DAO基因的表达。