利用3D生物打印模型探讨神经导向因子netrin-1在动脉粥样硬化疾病中的调控机制及作用

The prevention and treatment for traditional risk factors of atherosclerosis (AS) progress failed to effectively control the disease, so it is crucial to clarify the pathogenesis of AS in a more accurate disease model and find a new treatment. Our previous study found that circulating microRNA expression profile were significantly upregulated in atherosclerotic patients, and endothelial microvesicles (EMV) derived microRNAs played a role in cell-cell communication to regulate the inflammatory response in AS, which target a key protein neuroimmune guidance cue netrin-1. However, the mechanism of netrin-1 in AS is still unclear. Therefore, we propose to establish a three-dimensional (3D) bioprinting model, which will be more consistent with human and more accurate with disease microenvironment, to study the regulatory mechanism of netrin-1 in atherosclerosis. This project aims to investigate the following questions: 1. How does netrin-1 regulate endothelial cells and monocytes; 2. How does EMVs-derived microRNAs regulate netrin-1 and what are the downstream effects. The objective of our study is to clarify the molecular mechanism and biological effects of netrin-1 using 3D bioprinting model, and provide a theoretical basis for anti-AS treatment based on netrin-1.

现有针对传统危险因素的动脉粥样硬化（AS）防治手段仍未能有效控制疾病的进展，因此在能更准确模拟疾病的模型上真正了解AS的发病机制并寻找新的治疗方法是亟待解决的临床问题。我们前期研究发现，循环中存在一组AS疾病特异性的microRNAs，并由微囊泡携带发挥细胞间通讯作用，调控AS疾病的炎症反应，其核心靶向蛋白为神经导向因子netrin-1。但目前对于netrin-1在AS中的作用机制仍不清楚。因此，本项目拟在与体内一致性更高、模拟疾病微环境更准确的3D打印生物模型中，探讨：1.netrin-1作用于内皮细胞和单核细胞的生物学效应；2.内皮微囊泡携带microRNAs对netrin-1的调控机制。最终旨在新型的3D生物模型中，阐明调控netrin-1的分子机制及其下游的生物学作用，为开辟基于netrin-1的新型抗AS治疗策略提供理论依据。

本项目以3D生物细胞模型为核心创新工具，探讨神经导向因子netrin-1在动脉粥样硬化中的作用及调机制这一核心问题，阐明内皮源性微囊泡携带miR-128调控netrin-1的分子机制及其下游的生物学作用。我们首先从单细胞到多细胞逐步对体外构建类动脉粥样硬化早期单核细胞向内皮细胞迁移的生物模型的可能性和方案进行探索，将血管内皮混合物与水凝胶以不同比例混合，导入生物打印系统，以液滴式打印到培养皿内，而后以血管内皮完全培养基培养，确立合理的细胞和水凝胶浓度及检测时间点。随后采用低浓度芯片打印血管内皮细胞，结合单核细胞薄层打印，实现血管内皮的连续分布和单核细胞的迁移，构建了类动脉粥样硬化疾病微环境的三维生物模型，使得不同细胞均能够在三维立体空结构中迁移、分裂、分化，以实现细胞间通信。我们连续改变netrin-1表达，模拟动脉粥样硬早期内皮细胞改变，加入单核细胞，观察内皮细胞-单核细胞相互作用，单核细胞粘附、迁移至内皮的“跨血管”迁移，明确netrin-1在动脉粥样硬化早期抑制单核细胞向内皮细胞粘附、迁移，发挥抗动脉粥样硬化作用。进一步生物信息学提示netrin-1受miR-128调控。我们通过细胞学证实，内皮细胞通过旁分泌miR-128微囊泡方式调控单核巨噬细胞中neitrin-1表达。最后，我们通过双荧光素酶报告基因实验明确miR-128对netrin-1有直接调控作用。综上所述，我们在新型的3D生物模型中，证实了netrin-1表达受miR-128的直接调控，在动脉粥样硬化早期抑制单核细胞向内皮细胞粘附、迁移，发挥抗动脉粥样硬化作用，阐明调控netrin-1的分子机制及其下游的生物学作用，为开辟基于netrin-1的新型抗动脉粥样硬化治疗策略提供理论依据。