GmGPA3调控大豆贮藏蛋白后高尔基体转运的分子机理研究

Soybean is a primary source of vegetable protein for human consumption in China. Storage protein is the most abundant nutritional component in soybean seeds, and thus its content and composition directly affect the protein quality. Dissections of molecular mechanisms by which storage proteins synthesize, transport, and deposit in protein storage vacuoles (PSVs) would provide theoretical supports for breeders in soybean protein quality improvement. The proposer previously isolated a rice storage protein sorting deficient mutant named gpa3, and identified the GPA3 protein as an essential regulator required for efficient storage protein trafficking from the Golgi to PSVs. Using the combined biochemical and genetic approaches in heterologous system, we demonstrated that GPA3 can directly interact with small GTPase Rab5a’s nucleotide exchange factor VPS9a to regulate dense vesicle (DV) -mediated post-Golgi trafficking of storage proteins in rice. However, the molecular mechanism by which GPA3 regulates the directional targeting of DV still remain largely unknown. This project will try to elucidate the molecular mechanism of GmGPA3 (the only homolog of OsGPA3 in soybean) in regulating the directional soring of DV using a transient expression system in developing soybean cotyledons. The study results could expand our knowledge of plant-specific vesicular trafficking system, and provide theoretical directions for protein quality improvement in soybean.

大豆是我国人民重要的植物蛋白质来源。贮藏蛋白是籽粒中的第一大类营养物质，其含量和组成直接影响蛋白品质，因此，大豆贮藏蛋白合成、转运和沉积过程分子机理的研究对大豆蛋白品质改良具有重要意义。申请人利用水稻贮藏蛋白转运缺陷突变体gpa3，克隆了一个植物特异的调控贮藏蛋白后高尔基体转运的关键因子GPA3，异源系统互作研究初步证实GPA3可与小G蛋白Rab5a的鸟苷酸交换因子VPS9a组成一个蛋白复合体，协同调控致密囊泡介导的水稻贮藏蛋白的后高尔基体转运。然而，GPA3调控贮藏蛋白转运的分子机理尚不清楚。本项目拟利用大豆子叶瞬时表达系统，解析GPA3蛋白在大豆中的唯一同源蛋白GmGPA3调控致密囊泡定向分选的分子机理，探索该基因自然变异与大豆蛋白组分的关系，进而拓展人们对植物特异的囊泡转运系统的认知，同时也为大豆蛋白品质的改良提供理论支撑。

大豆是我国人民重要的植物蛋白质来源。贮藏蛋白作为大豆中的第一大类营养物质，其含量和组成直接影响大豆蛋白品质。模式植物拟南芥和水稻已经建立了较为完善的贮藏蛋白合成、分选以及沉积的分子网络途径，然而大豆中该方面的研究尚未见报道。.GPA3、VPS9a以及Rab5a是水稻中已经证实的3个调控贮藏蛋白后高尔基体分选的关键因子，生化和遗传实验证实三者可形成一个功能蛋白复合体，协同调控致密囊泡介导的后高尔基体的分选。在本研究中我们利用同源克隆的方法克隆了上述3个基因在大豆中的同源基因，包括GmGPA3，GmVPS9a1，GmVPS9a2，GmVPS9b，GmRab5a。表达分析显示上述基因均在下胚轴和种子中大量表达，暗示它们可能参与调控贮藏蛋白的分选。上述基因融合GFP转化水稻相应突变体后均能互补贮藏蛋白的分选缺陷，表明它们至少在水稻中具有调控贮藏蛋白分选的功能。酵母双杂交结合免疫共沉淀实验证实：①GmGPA3与GmVPS9s各成员均存在强的物理互作关系；②GmVPS9a2特异与GmRab5a互作，GmVPS9b与GmRab5a和GmRab5bs均互作。上述生化实验表明GmVPS9s在大豆中可能出现了功能分化。在大豆子叶瞬时表达系统中GmGPA3和GmVPS9s均定位在细胞质中，而GmRab5a则分布在反面高尔基体管网结构和前液泡区室中。在大豆子叶瞬时表达系统中，我们利用RNAi和过表达GmRab5a 显性负抑制形式的方法均证实GmRab5a在大豆体内确实具有调控贮藏蛋白分选的功能。GmVPS9s各成员的干扰实验也证实GmVPS9a2和GmVPS9b可能通过调控GmRab5a的活性状态参与贮藏蛋白的后高尔基体分选。通过上述实验，我们基本阐明以VPS9为中心的GmGPA3-GmVPS9s-GmRab5a复合体调控贮藏蛋白分选的功能在大豆中也高度保守存在，但大豆GmVPS9s成员出现了功能分化。.通过本项目的实施，我们基本阐明了后高尔基分选复合体GPA3-VPS9-Rab5a在大豆中调控贮藏蛋白分选的分子机制。我们的研究利用大豆子叶瞬时表达系统首次“原位”解析了Rab5a介导的大豆贮藏蛋白后高尔基体分选的分子调控网络，为全面解析大豆贮藏蛋白合成、转运和沉积途径奠定基础，也为大豆蛋白品质改良提供理论支撑。