核仁蛋白Bmsl1在斑马鱼肝脏早期发育过程中的功能研究

从斑马鱼突变群体中我们筛选到一个小肝脏突变体sq163。利用map-based cloning方法我们克隆了sq163。基因序列分析发现sq163 变异发生在bmsl1基因第5外显子，是一个T到A的置换变异。该变异导致密码子CTG变为 CAG，进而导致Bmsl1 蛋白154位亮氨酸被 谷氨酰胺替代。Bmsl1是一个核仁蛋白，目前只在酵母中被研究，在其它生物中尚无报道。所知的Bmsl1的生化功能是在核仁中帮助核糖体18S rRNA成熟及40S核糖体亚基组装，但对其是否在器官发生发育过程中起作用一无所知。通过前期的研究我们已获得与sq163突变相关的丰富结果，所拟研究计划将通过生化、细胞、分子生物学分析手段详细研究Bmsl1如何参与斑马鱼消化器官的发育。所获结果不仅加深我们对Bmsl1功能的了解及对肝脏发育的分子机制的认知，且有助于我们对人类'ribosomapathy'相关疾病的研究。

Bmsl1是一个核仁蛋白，除酵母外在其它生物中尚无详细研究报道。Bmsl1通过调节另一个核仁蛋白Rcl1来参与核糖体18S rRNA成熟及40S核糖体亚基组装，但对Bmsl1是否在脊椎动物器官发生发育过程中起作用一无所知。本项目集中研究Bmsl1如何参与斑马鱼肝脏的发育，主要研究成果总结如下：.1、用内胚层分子标记及肝脏分子标记做原位杂交显示bms1lsq163突变主要影响消化器官后期的发育生长过程。.2、TUNEL检测结果证明肝脏变小不是由于细胞凋亡引起。.3、检测PCNA表达及Edu掺入情况，发现在bms1lsq163突变体肝脏中PCNA+和Edu+阳性细胞显著多于正常对照，而PH3阳性细胞数目显著少于正常对照。这些结果说明bms1lsq163突变体肝脏变小是由于细胞增殖受阻于G2→M期而不是G1→S期。.4、检测核仁标识蛋白发现正常鱼的肝脏中含一个核仁的细胞占~60%，两个核仁的占~30%，多于两个的占~10%。而在bms1lsq163突变体肝脏中，含一个核仁的细胞只占~30%，多于两个的占~30%，说明Bms1l失活后影响核仁的发生和解体。.5、比较突变体及正常对照中p53蛋白水平，发现bms1lsq163突变体中p53蛋白异常高表达。实时定量PCR检测发现突变体中p53下游基因，如Δ113p53和p21等均异常高表达，说明bms1lsq163突变体中p53通路被异常激活。但斑马鱼bms1l sq163/ p53M214K双突变体只能部分拯救bms1l sq163突变体小肝脏表型，且斑马鱼bms1l sq163/ p53M214K双突变体肝脏中多核仁细胞数量仍显著高于野生型。.6、上述结果说明有p53上游因子或独立于p53信号通路被激活，从而使肝脏细胞增殖受到阻滞。为此，检测DNA损伤应答因子CHK2和RPA2蛋白水平，发现bms1l sq163突变体中二者蛋白表达水平显著上升。检测复制叉复合体成员PCNA和Fen1蛋白表达水平，发现bms1l sq163突变体中二者蛋白水平同样显著上升。由此推断在bms1l sq163突变体中存在DNA复制损伤修复异常的现象。.总结：研究结果基本确定Bms1l失活不仅导致18S rRNA加工成熟异常也导致DNA复制损伤修复异常，这些结果为下一步探索Bms1l是否通过参与细胞周期调控而控制肝脏发育打下了基础。