蓝藻的琥珀酰修饰组及其在光合作用中的功能和分子调控机制研究

Lysine succinylation is a newly identified protein post-translational modification pathway present in both prokaryotic and eukaryotic cells; however, its extent and function in cyanobacteria remain unexplored. In this study, we will perform a global succinylome analysis in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 by using high accuracy nano-LC-MS/MS to identify all the succinylated peptides and sites. The identified succinylated proteins involved in the photosynthesis process will be further studied. Both non-succinylated and mimic- succinylated mutants will be constructed by using site-directed mutagenesis. The in vivo characterization of these mutants will be performed to understand the roles of succinylation in the photosynthesis. Also, we will identify and characterize all potential acetylases and deacetylases in this model cyanobacterium. The results will provide a rich resource for functional analyses of lysine succinylation and facilitate the dissection of photosynthesis process in cyanobacterium.

赖氨酸的琥珀酰化修饰是新近发现的一种蛋白质翻译后修饰，调控包括信号通路、代谢和蛋白质稳定性等众多的生物学过程。但在蓝藻中尚未见报道。本项目拟以模式蓝藻-聚球藻（Synechococcus sp. PCC 7002）为研究对象，采用翻译后修饰组学和功能研究相结合的研究策略，准确、全面鉴定出聚球藻中琥珀酰化修饰蛋白及其位点；重点关注光合作用相关蛋白的琥珀酰化修饰与位点，构建其修饰位点突变菌株，结合生理生化和光合参数的测定来研究琥珀酰化修饰对光合作用过程的影响及其调控的分子机制。并对聚球藻中的所有潜在的琥珀酰转移酶和去琥珀酰化酶进行系统鉴定和确认的工作，在此基础上，检测其作用的底物。以上工作的完成，将为全面、系统理解琥珀酰化修饰系统在蓝藻中的功能以及参与调控光合作用的分子作用机制打下基础，也为系统性地探索重要蛋白质翻译后修饰及其功能和作用机制提供一种新的研究思路和研究方法。

本研究基于高分辨率质谱的蛋白质组学研究方法对聚球藻PCC 7002中琥珀酰化修饰位点进行了大规模的鉴定。首先，培养并收集不同处理条件下的野生型聚球藻PCC 7002细胞，提取蛋白后进行溶液酶解；然后借助特异性的赖氨酸琥珀酰化修饰抗体对琥珀酰化修饰肽段进行富集，最后使用液相色谱-质谱联用仪对琥珀酰化修饰肽段进行大规模的鉴定。通过得到的数据运用生物信息学的方法对鉴定到的琥珀酰化蛋白进行GO功能注释分析，蛋白相互作用网络分析，KEGG代谢通路分析等，进一步的挖掘琥珀酰化修饰在光合作用过程中扮演的角色。基于我们所得到的琥珀酰化蛋白和生物信息学分析，我们选择了光合系统II锰簇稳定蛋白（PsbO）进行相应的功能研究.通过点突变的方式分别获得模拟琥珀酰化修饰和模拟没有琥珀酰化修饰的PsbO突变株，然后对突变株进行表型分析，以找出琥珀酰化修饰具体的调控功能。最后，我们将通过分子动力学模拟对相关蛋白修饰前后的空间构象进行分析，并阐明了琥珀酰化修饰调控光合作用的分子机制。