DNA-蛋白质交联损伤修复蛋白Wss1结构及功能研究

DNA–protein crosslinks (DPC) are highly toxic DNA lesions because they interfere with DNA transactions and lead to cell death. Wss1 is a kind of protease which is able to decompose the protein component of DPC and enables the living organism to replicate their genetic information normally. Nowadays, our knowledge about this protein is still limited in the cellular level. The three dimensional structure of Wss1, and its interactions with DNA, Cdc48, ubiquitin are still elusive. In this project, we aim to solve the structure of Wss1 from saccharomyces cerevisiae using X ray crystallography combined with small angle X-ray scattering (SAXS). Then, further efforts will be paid to find the catalytic sites of Wss1 using mutation experiments. The research will contribute to our knowledge about this protein in the molecular level, enable us to understand the mechanism of Wss1 in repairing DPC, and provide us a structural basis for designing anti-cancer drugs.

DNA-蛋白质共价交联是一种非常严重的DNA损伤，它会阻碍DNA正常的解旋及复制过程，导致细胞正常分裂受阻以至细胞死亡。Wss1是一种蛋白酶，它能够剪掉DNA-蛋白质交联中的蛋白组分，使生物体得以正常复制它们的遗传信息。目前对该蛋白的研究局限在细胞水平。对于其三维结构，及其与DNA，Cdc48，泛素等配体的相互作用机制还不清楚。本课题将以酿酒酵母的Wss1作为研究对象，利用X射线晶体学与小角散射相结合的方法解析其三维结构，并进一步研究Wss1与相关底物的相互作用，将其组装成均一稳定的复合物，尝试解析复合物结构。结合定点突变结果，找出Wss1与底物结合的相互作用位点，以及行使蛋白酶催化功能的活性位点，在分子水平上认识其参与修复DNA-蛋白质链间交联的过程和作用机理。研究成果将对基因组完整性和癌症发展的理解有重要意义，还将为新型抗癌药物的设计提供参考依据。

在生物体生长代谢过程中，由于各种内源或者外源因素都会形成有害的蛋白质-DNA交联体(DPCs)。DPCs对细胞有巨大毒害，它们会抑制解旋酶对DNA的解旋，抑制复制的进程，进而抑制细胞分裂导致细胞死亡。Wss1 是一种金属蛋白酶，其通过降解DPCs中的蛋白组分来降解DPCs，消除DPCs对细菌的伤害。为了更深入的了解其结构是如何决定发挥功能的，本项目选取了酿酒酵母中的金属蛋白酶Wss1(简称ScWss1，该蛋白已被证明以一种DNA依赖的方式发挥酶解活性)进行研究。我们成功得到ScWss1及其活性位点突变体ScWss1116E-Q以及ScWss1-DNA复合体晶体。通过X射线衍射技术，我们解析了ScWss1催化核心部分结构及其活性位点突变体ScWss1116E-Q截短的部分结构。全长结构通过X射线小角散射实验来表征。Wss1家族蛋白保守部分为降解DPCs中蛋白组分的蛋白酶结构域，其包含一个最保守的结合锌离子的HEXXH模体。通过对ScWss1以及SpWss1的结构比对分析，我们认为电子势能表面分布的不同以及底物结合沟的缺失对于ScWss1识别底物具有重要的影响。通过对缺乏水解活性的Proabylysin蛋白以及ScWss1结构分析以及小角散射模型比对，我们推测出Wss1单独存在时，C端插入活性中心，阻挡底物进入从而“关闭”酶活; DNA存在时，C端与DNA结合，释放活性中心，底物进入从而“开启”酶活。