基于转录组学的硝酸盐释放莴苣种子热休眠的分子机制研究

Seed thermodormancy is a common biological phenomenon in vegetables and crops, and result in yield losses due to failures or delays in germination and seedling emergence. So releasing thermodormancy is an important problem in agricultural production. Many techniques have been developed to release seed thermodormancy, but the molecular mechanism of thermodormancy release is unknown. Lettuce seed which exhibits a typical thermodormancy is an excellent model to study mechanism of thermodormancy release. Our studies indicate that exogenous nitrate was effective to release lettuce seed thermodormancy. In this project, we combine the techniques of seed physiology, molecular biology and transcriptome, particularly the RNA-seq technique; and investigate (1) the germination of lettuce seeds in response to temperature and nitrate; (2) the effects of nitrate on contents of ABA, GA and ethylene in lettuce seeds; (3) the effects of nitrate on transcriptome of lettuce seeds imbibed at high temperature; (4) the gene regulation networks of lettuce seed thermodormancy released by nitrate; (5) the expression patterns of key genes to elucidate the gene regulation networks of lettuce seed thermodormancy released by nitrate and key genes involved in the process. Our research will enhance the knowledge to better understand the molecular mechanisms of seed thermodormancy release, and provide novel techniques to plant lettuce seeds throughout the year.

种子的热休眠是一种普遍的生物学现象，会引起发芽率降低、萌发延迟和出苗不齐，导致蔬菜和农作物减产。释放种子的热休眠是农业生产中亟待解决的重要问题。虽然已对释放热休眠在生理水平展开了大量研究，但是其分子机制仍然不清楚。莴苣种子具有典型的热休眠特性，是研究热休眠释放机制的理想材料。我们的研究表明外源硝酸盐能有效地释放莴苣种子的热休眠。本项目集成种子生理学、分子生物学和转录组学技术，尤其是RNA-seq技术；研究 (1) 莴苣种子萌发对温度和硝酸盐的反应；(2) 硝酸盐对莴苣种子的ABA、GA和乙烯含量的影响；(3) 亚高温下硝酸盐对莴苣种子转录组的影响；(4) 硝酸盐促进莴苣种子热萌发的基因调控网络；以及(5) 差异表达的重要基因的表达特征分析；阐明硝酸盐释放莴苣种子热休眠的基因调控网络与关键基因。研究结果将为解释种子热休眠释放的分子机制提供新的知识，也将为莴苣种子的全季节播种提供新技术。

莴苣种子在高温下萌发时呈现典型的萌发热抑制，硝普钠处理能打破莴苣种子的萌发热抑制。然而，种子萌发热抑制及其释放的分子机制尚不明确。为了研究这一机制，我们利用适宜温度 (19°C) 和亚高温吸胀 (27°C) 的水中以及亚高温吸胀 (27°C) 条件下，在100 μM硝普钠中吸胀0，3，6，12，24和36小时的种子为研究材料，首先1) 混合上述RNA 样品，利用Illumina双端测序技术进行测序，最终一共获得147,271,347原始序列并利用这些序列拼装萌发莴苣种子的转录组。我们共得到51,792个unigenes，这些unigenes的平均长度为849 bp。在这些unigenes中，共有29,542 个unigenes在数据库中被注释，这些数据库是NCBI非冗余数据库 (NCBI non-redundant protein database)、SwissProt蛋白质数据库 (SwissProt protein database)、真核同源数据库(eukaryotic Ortholog Groups database)和NCBI核酸数据库(NCBI nucleotide database)。当在京都基因与基因组途径数据库(KEGG database) 检索注释的unigenes时，一共有8,810个unigenes被注释到260个途径的5个类别中。我们首次在莴苣中发现了多个脱落酸信号应答基因，包括11个脱落酸受体，94个蛋白磷酸酶和16个蔗糖非发酵1相关蛋白激酶。2) 分别对上述实验材料进行单端测序，通过与转录组比对，获得相应的序列，并对这些序列进行注释，分析比较在正常萌发、萌发热抑制和萌发热抑制释放的条件下的差异基因，这一结果有助于我们更好的了解莴苣种子萌发、萌发热抑制及其释放的分子机制。