Tak1基因负性调控巨噬细胞的信号转导通路研究

Tak1 在T、B细胞中起关键作用。申请者研究发现Tak1基因，与在T、B细胞中的作用不同，在髓样细胞中呈负性调控作用。Tak1基因敲除小鼠经LPS攻击，虽阻断了TAK1-IKK/MAPK信号通路，却产生大量炎性细胞因子，易发生内毒素休克死亡。表明Tak1基因并非仅仅依靠TAK1-IKK/MAPK信号通路完成细胞因子的产生和释放，还存在一种依赖Tak1的抑制机制。提出假说认为：Tak1基因敲除，虽阻断了TAK1-IKK/MAPK信号通路，却因为失去了抑制MEKK3磷酸化的调控作用，启动了MEKK3依赖途径，NF-κB持续激活，诱导JNK和p38活化，导致炎性细胞因子释放，加速小鼠发生内毒素休克致死。本课题采用Tak1基因下调和过表达技术，研究Tak1－MEKK3抑制信号通路及其下游关键激酶活性,揭示Tak1基因在巨噬细胞的负性调控机制，为机体免疫系统调控内毒素休克等炎症应答提出新的机制。

一、.项目的背景.我们实验观察到Tak1基因缺失后，并没有抑制LPS激活TLR信号通路，反而加速产生炎性细胞因子。说明LPS除通过Tak1－IKK/MAPK信号通路刺激髓样细胞产生细胞因子，还存在其他途径，并受Tak1调控。申请者提出假说认为： Tak1基因敲除，虽然阻断了Tak1－IKK/MAPK信号通路，然而，因为失去了抑制MEKK3磷酸化的调控作用，启动了MEKK3依赖途径，导致炎性细胞因子的释放增加，加速小鼠发生内毒素休克致死。.二、.主要研究内容.1..实验细胞处理: Tak1 siRNA敲低或Tak1过表达，炎性细胞因子（检测IL-1β、IL-6、TNFα）。.2..Tak1对MEKK3的抑制作用：①Tak1-MEKK3复合物检测；②Tak1抑制MEKK3介导NF-κB活性；③Tak1抑制MEKK3磷酸化.3..Tak1及其磷酸化检测：Western Blot技术。.4..MEKK3及其磷酸化检测：Western Blot技术。.5..下游信号转导蛋白检测：Western Blot技术.6..下游信号转导蛋白磷酸化检测：Western Blot技术 .7..NF-κB活性检测.三、.重要结果及关键数据.TAK1 siRNA干扰后，TAK1表达量降低，炎症反应却增强，说明LPS刺激巨噬细胞，存在依赖TAK1的抑制NF-κB活性机制。.利用Western Blot技术检测活化Tak1能够抑制MEKK3磷酸化，而且呈剂量依赖关系；相反，Tak1基因下调，MEKK3磷酸化增强。采用免疫共沉淀技术研究TAK1和MEKK3的相互作用，证明TAK1对MEKK3起到直接抑制作用。首次证明TAK1能直接和MEKK3结合，对MEKK3活性的抑制作用方式可能是直接抑制作用。.利用双荧光素报告系统检测NF-κB活性，也证明TAK1对MEKK3的抑制作用。对于本课题的核心科学问题即TAK1对髓样细胞的负性调控作用机制进行了阐明。..四、.科学意义.揭示Tak1基因在巨噬细胞，不同于T、B细胞，发挥负性调控的作用机制，丰富免疫调节网络的认识，为进一步研究机体免疫系统维持和调控免疫应答机制提供新的视角。