脊髓缺血再灌注损伤中右美托咪定介导的线粒体保护机制研究

Ischemia-reperfusion injury is the tissue cell damage caused by blood supply when circulation returns to the tissue after a period of ischemia. This creates a condition in which the restoration of blood flow results in inflammation and damage of mitochondria. The protective effect of the α2-adrenergic receptor agonist, dexmedetomidine, on spinal cord ischemia-reperfusion injury has been verified, but there is no clearly information whether the protective effect is associated with mitochondrial dysfunction. To this end, spinal cord neurons cell ischemia-reperfusion injury model of SD rat will be used to characterize the expression of mitochondrial calcium uniporter, uptake 1, and uptake 2 (MCU, MICU1, MICU2) and Nrf2 by siRNA mediated gene silencing. The effect of dexmedetomidine on neurons injured by reperfusion and mitochondrial dysfunction will be analyzed by indirect immunofluorescent assay, Western blotting and laser scanning confocal microscopy. The spinal cord ischemia reperfusion model in vivo will be established and the protection of dexmedetomidine on spinal cord injury and the expression of Nrf2/ARE, glutamic acid receptor, caspase-3 will be analyzed by BBB scoring, histopathology and flow cytometry. Combined with the results of experiment in vitro, the protective mechanisms of dexmedetomidine on spinal cord ischemia-reperfusion injury to mitochondria will be explored. This will pave a new way to demonstrate the molecular targets for veterinary clinical intervention and protection on spinal cord ischemia-reperfusion injury.

脊髓缺血再灌注损伤（SCIRI）与神经元细胞一系列炎症反应、氧化应激和线粒体功能障碍有关。研究发现，α2肾上腺素受体激动剂右美托咪定(DEX)对SCIRI具有保护作用。那么，这种保护作用是否与稳定线粒体功能有关呢？本研究将通过构建SD大鼠脊髓神经元离体缺血再灌注模型，利用siRNA基因沉默技术干扰线粒体钙离子单向转运蛋白及其调节蛋白MICU1/2和Nrf2/ARE抗氧化通路关键分子Nrf2的表达，探索DEX预处理对再灌注损伤神经元及线粒体机能的影响。利用在体大鼠SCIRI模型，通过BBB评分、免疫组化、流式细胞术等方法，观察DEX预处理后脊髓神经元中Nrf2/ARE通路蛋白、谷氨酸受体及caspase-3等蛋白表达变化，解析DEX对脊髓再灌注损伤的保护机制。结合体外实验，探讨DEX预处理对SCIRI保护的线粒体稳定机制。本项目将为兽医临床SCIRI的干预和防护提供理论依据和分子靶标。

脊髓缺血再灌注损伤（SCIRI）是大动脉手术、脊柱手术等术后常见的并发症，严重者可引起四肢瘫痪甚至死亡，目前尚无有效治疗方法，当前研究热点主要是通过药物干预。右美托咪定（Dex）是临床常用的镇静剂，近年来研究发现其在激活α2受体同时具有抗炎、抗凋亡等多器官保护作用。本项目通过建立在体动物模型和离体细胞模型，探索Dex预处理后对缺血再灌注损伤的干预机制，重点分析在此过程中神经元线粒体与钙离子变化的分子机制。利用稳定传代的PC12细胞经过Dex前处理后研究发现，在模拟缺血再灌注后，神经元胞内钙离子显著增加，这提示神经元在发生缺血再灌注损伤后胞内钙离子稳态被打破，出现钙离子超载，而且胞内钙离子上升数量比未经处理的细胞要低，这一结果说明因此Dex的保护作用可能与钙离子有密切关系。而胞内钙离子的变化可能与线粒体膜电位、MPTP开放的程度有关。进一步分析线粒体膜电位、MPTP的变化发现，二者变化与钙离子变化趋势保持一致，结合Cytc、Caspase-3蛋白表达情况，我们推测Dex可能调节细胞内钙离子外流，抑制MPTP的开放程度，稳定线粒体膜电位水平，抑制线粒体的崩解，进一步降低CytC的表达与Caspase凋亡程序的激活，保护脊髓缺血再灌注损伤过程中的细胞损伤，这可能是Dex的保护作用机制。在动物模型试验中，分析了线粒体钙离子转运蛋白MICU1的表达变化，脊髓组织中MICU1的表达未出现明显差异，但是缺血再灌注后神经元线粒体内膜MICU1表达情况显著低于Dex预处理组，这一结果说明脊髓缺血再灌注后神经元线粒体MICU1蛋白表达降低，导致线粒体内钙离子升高，而右美托咪定预处理能够激活MICU1蛋白表达，在一定程度上缓解了线粒体内钙离子的升高。线粒体内钙离子升高导致线粒体崩解，激活抗氧化通路，因此我们又进一步分了Nrf2抗氧化调控通路及其调节的HO-1、NQO-1等II相解毒酶的表达，研究发现，Dex干预后Nrf2蛋白特别是胞核中Nrf2蛋白表达量显著高于缺血再灌注组，说明Dex干预后激活了Nrf2，而其调控的下游因子HO-1和NQO-1的蛋白水平变化趋势也与Nrf2保持一致，结合Bcl-2和促凋亡因子Bax表达量的变化趋势，Dex干预后能够激活MICU1蛋白和Nrf2，上调其调节的下游酶因子的表达，这可能是Dex具有脊髓缺血再灌注损伤保护作用的可能机制之一。