m6A阅读器蛋白家族YTHDF调控mRNA在轴突内局部翻译和转运的机制研究

N6-methyladenosine (m6A) is the most common internal modification in mRNA. The main function of m6A is to finely tune gene expression through various post-transcriptional mechanisms, which further regulate different biological processes. Our previous studies demonstrated that excess m6A modification level inhibited local translation in axons. However, the precise mechanism is still not clear. Our preliminary results have shown that the m6A readers YTHDF1 and YTHDF2 have high expression in axons of cerebellar granule cells, and knockdown of YTHDF1 or YTHDF2 led to increased axonal elongation rate. We hypothesize that YTHDFs mediate m6A functions by regulating local translation in axons and then control axon elongation. In this project, we will utilize microfluidic, molecular and cellular methods and techniques to study: (1) the roles of axonal m6A readers YTHDFs in axon elongation; (2) the mechanisms regulating local translation in axons by axonal YTHDFs; (3) the mechanisms regulating transport and localization of mRNA in axons by YTHDFs. Our results will elucidate the novel mechanisms regulating transport, localization and local translation of axonal mRNA by dynamic m6A modification.

N6-甲基化腺苷（m6A）是mRNA中最普遍的内部修饰，其主要功能是在转录后水平上对基因表达进行精细调控，进而调控各种生物进程。我们之前的研究表明神经元轴突中过高的m6A水平可以抑制轴突中mRNA的局部翻译，但是其机制并不清楚。我们前期研究发现m6A阅读器蛋白YTHDF1和YTHDF2在小脑颗粒神经元轴突中有较高的表达，而敲低YTHDF1和YTHDF2导致轴突伸长加快。我们假说m6A通过其阅读器蛋白调控轴突中mRNA的局部翻译，进而调控轴突伸长。本课题将利用微流控、分子生物学和细胞生物学等方法和技术研究：(1)神经元轴突中m6A阅读器蛋白YTHDFs对轴突伸长的调控作用；(2)YTHDFs调控轴突中mRNA局部翻译进而控制轴突伸长的机制；(3)YTHDFs对mRNA向神经元轴突中转运和定位的调控机制。研究结果将阐明m6A动态修饰调控轴突中mRNA转运、定位和局部翻译的新式机制。

N6-甲基化腺苷（m6A）是mRNA中最普遍的内部修饰，其主要功能是在转录后水平上对基因表达进行精细调控，进而调控各种生物进程。我们之前的研究表明神经元轴突中过高的m6A水平可以抑制轴突中mRNA的局部翻译，但是其机制并不清楚。本项目的前期研究发现m6A阅读器蛋白YTHDF1和YTHDF2在小脑颗粒神经元轴突中有较高的表达，而敲低YTHDF1和YTHDF2导致轴突伸长加快。在此基础上，本项目利用微流控、分子生物学和细胞生物学等方法和技术研究了：(1)神经元轴突中m6A阅读器蛋白YTHDFs对轴突伸长的调控作用；(2)YTHDFs调控轴突中mRNA局部翻译进而控制轴突伸长的机制；(3)利用定量微流控芯片进行轴突转录组学研究。项目取得了以下重要结果。利用YTHDF1和YTHDF2特异性抗体进行RIP实验，pull down和YTHDF1和YTHDF2结合的mRNA，并进行RNA测序分析和GO分析。在小鼠P4~6小脑颗粒神经元中敲低YTHDF1和YTHDF2后分别进行MS和RNAseq，鉴定YTHDF1和YTHDF2被敲低后表达变化的mRNA及其蛋白质，并对MS和RNAseq数据进行GO分析。通过对以上实验的结果进行综合分析，鉴定出分别与YTHDF1和YTHDF2结合并被其调控翻译和稳定性的mRNA。编码Wnt5a信号通路重要分子Dvl1和Wnt5a的Dvl1和Wnt5a mRNA分别是YTHDF1和YTHDF2的靶mRNA。YTHDF1调控Dvl1 mRNA的翻译，YTHDF2控制Wnt5a mRNA的稳定性进而控制其翻译。对Dvl1和Wnt5a mRNA进行siRNA敲低后发现对GC轴突生长的调控分别符合YTHDF1和YTHDF2的作用。利用轴突RNA的RT-PCR和FISH证明了Dvl1和Wnt5a mRNA在小鼠小脑颗粒神经元（GC）轴突中存在并可以进行局部翻译。制作了小鼠小脑颗粒神经元（GC）特异性Ythdf1和Ythdf2敲除小鼠，这两个cKO小鼠都不影响小鼠小脑颗粒神经元（GC）产生，但是其轴突伸长都被促进了。这两个cKO小鼠小脑的兴奋性突触增多，运动协调性变得更好。本项目研究结果阐明了m6A动态修饰通过其阅读器蛋白YTHDF1和YTHDF2调控轴突中mRNA局部翻译进而控制神经元轴突伸长的新式机制。