周氏啮小蜂识别寄主挥发物的气味受体（OR）鉴定及功能分析

Chouioia cunea Yang is an important wasp using biological control agents to defend Hyphantriacunea(Drury). Nowadays, most studies focus on the morphological characteristics and the biological control of C. cunea, but with little knowledge about host recognition mechanism and olfactory gene discovery of C. cunea. Our recent studies have found 25 odorant binding proteins (OBPs), 1 Odorant receptor coreceptor (Orco) and 6 normal odorant receptor(OR) genes and 73 odorant receptor partial genes from the male and female adult C. cunea antennal transcriptomes. Furthermore, one odorant binding proteins CcOBP2 was cloned, and expressed in E.coli. Fluorescence binding assays showed that CcOBP2 had strong binding affinities with Hyphantria cunea Pupal volatiles such as naphthalene, amyl aldehyde and 1 - pentene - 3 alcohol. Therefore, the present study aims to screen the Odorant receptor CcOR which specific binds to CcOBP2 by immunoprecipitation-mass spectrometry (IP-mass spec) analysis, and confirm the interaction between the CcOR and the CcOBP2. Then the possible molecular mechanism of C. cunea will be explored to identify the host volatiles compounds. The study on the molecular mechanism of insect olfaction provides new ideas and approaches for biological control, and this is an ideal model for the study of the olfactory sense in the human behavior.

周氏啮小蜂是美国白蛾的重要寄生性天敌，目前对其研究主要停留在形态学，行为学及防治技术水平上，对周氏啮小蜂的寄主识别机制及嗅觉基因发掘方面的研究尚属空白。本课题组通过对其触角转录组测序，得到24个气味结合蛋白（CcOBP）基因全序列，一个非典型气味受体基因（CcOrco）全序列，6个普通气味受体（CcOR）基因全序列和73个CcOR基因序列片段。我们体外表达、纯化得到触角特异性表达的气味结合蛋白CcOBP2，通过荧光结合实验筛选得到萘、正戊醛、1-戊烯-3-醇等白蛾蛹的挥发性气味分子与之结合。本课题拟在现有研究基础上，应用免疫共沉淀联合质谱技术筛选与CcOBP2特异结合的CcOR，深入研究该CcOR与CcOBP2作用方式，为阐明周氏啮小蜂识别寄主挥发物的分子机制奠定基础。本课题通过对昆虫嗅觉识别机制的研究，不仅为害虫防治提供了新的思路和途径，也为研究脊椎动物及人的嗅觉行为提供了理想的模型。

昆虫的嗅觉系统在其与外界环境进行交流、觅食、躲避敌害、求偶与交配、搜寻寄主等过程中起关键作用，目前昆虫嗅觉方面的研究主要集中在有害昆虫中，对于天敌昆虫，尤其是寄生性天敌昆虫的研究较少。本项目以世界性检疫害虫美国白蛾的寄生性天敌白蛾周氏啮小蜂为实验材料，首先，应用荧光结合实验从美国白蛾蛹和植物挥发物中筛选与小蜂触角特异性表达的气味结合蛋白CcOBP2特异性结合的气味分子，发现对小蜂有明显引诱作用的萜烯类化合物3-蒈烯与CcOBP2特异性结合，应用dsRNA特异性敲降CcOBP2表达，该引诱作用明显降低；此外，3-蒈烯对小蜂的宿主美国白蛾有明显的趋避作用。其次，应用转录组测序检测另一种对小蜂有明显引诱作用的美国白蛾蛹挥发物（1-十二烯）刺激前后小蜂的基因表达发现，除CcOBP7、CcOBP18、CcCSP4、CcOR2与CcGR18表达上调外，1-十二烯处理还导致31个基因表达上调，22个基因表达下调。最后，对三种鳞翅目昆虫（美国白蛾、柞蚕、舞毒蛾，均为白蛾周氏啮小蜂的寄主）的蛹挥发物成分分析发现三种宿主蛹的活性挥发物均含有1-十二烯、正十六烷等6种成分，但相对含量不同，导致其对周氏啮小蜂的引诱作用不同，美国白蛾蛹对周氏啮小蜂的引诱作用最强，其次是柞蚕蛹、舞毒蛾蛹。综上，本项目鉴定了一种与小蜂气味结合蛋白CcOBP2特异性结合的，对天敌（小蜂）有引诱作用，对害虫（美国白蛾）有趋避作用的萜烯类化合物3-蒈烯；并通过高通量测序积累小蜂转录组数据，通过GC-MC及GC-EAD实验鉴定得到6种对小蜂有明显引诱作用蛹挥发物活性成分，为进一步研究寄生昆虫的嗅觉识别分子机制奠定基础。