脐血单个核细胞促进神经干细胞增殖与分化及其机制研究

脐血库的兴起为新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的治疗带来了希望。脐血单个核细胞(UCBMC)含有许多前体干细胞，我们研究发现UCBMC脑内移植后可以存活，并促进内源性神经干细胞（NSCs）的增殖，具有神经保护作用。在此基础上，本课题采用磁共振活体示踪UCBMC的脑内迁移，采用免疫荧光双标法、激光共聚焦法、RNA干扰、蛋白质组学等方法，从细胞实验与动物实验两个层面动态系统地观察UCBMC对NSCs分化的影响，检测Hedgehog、Wnt信号通路中Hedgehog、Ptc、Gli、Wnt等重要信号分子的变化，以探讨UCBMC促内源性NSCs增殖与分化的机制。提出UCBMC可通过Hedgehog、Wnt信号激活内源性NSCs的增殖与分化，修复HIBD。本课题综合多门学科的新理论与新技术，从Hedgehog、Wnt信号通路探讨UCBMC对NSCs的影响，为UCBMC的临床应用提供科学的理论依据。

脐血单个核细胞（UCBMC）可促进神经营养因子的分泌与神经再生，有益于缺氧缺血性脑损伤（HIBD）的治疗，故本研究采用免疫荧光四重染色法、Western-blots法探讨UCBMC对NSCs增殖与分化的影响，并采用免疫荧光双标法、Real-time PCR法、Western-blots法及RNA干扰法等方法基于Hedgehog/Wnt信号通路从动物实验与细胞实验两个层面探讨其信号机制。MRI活体监测与免疫荧光检测结果发现UCBMC脑内移植后可以存活并分化为成熟的神经细胞。本研究体内动物实验发现UCBMC脑内移植可促进HIBD内源性NSCs的增殖，同时发现Hedgehog/Wnt信号通路Shh，Gli1，β-Catenin，CyclinD1等重要分子表达均增加，而脑内注射hedgehog分子的拮抗剂cyclopamine，发现诸信号分子表达均降低，NSCs的增殖亦减少，提示UCBMC脑内移植后NSCs的增殖与Hedgehog/Wnt信号有关；研究还发现UCBMC脑内移植可促进内源性NSCs分化为成熟的神经细胞，以神经元为主，星形胶质细胞分化减少，同时发现Hedgehog/Wnt信号通路诸信号分子表达增加，而BMP4分子表达下降，而脑内注射hedgehog分子的拮抗剂cyclopamine，发现Ngn1分子表达下降，而BMP4分子表达上升，提示UCBMC脑内移植后内源性NSCs的分化与Hedgehog/Wnt信号通路有关。体外细胞实验研究发现UCBMC与HIBD培养的NSCs采用Transwell小室系统共培养，可以促进NSCs的增殖，且发现Hedgehog/Wnt信号诸分子的表达均增加，而RNA干扰Shh或Gli1基因后，下游信号分子的表达亦下降，NSCs增殖减低，提示UCBMC通过Hedgehog/Wnt信号通路调控NSCs增殖。本研究细胞实验还发现UCBMC可促进NSCs的分化，以神经元为主，减少其向星形胶质细胞分化，同时，发现Ngn1 表达显著增加，BMP4表达显著减少。RNA干扰Shh及Gli1基因后，Ngn1表达显著减少，而BMP4表达显著增加，神经元分化减少，而星形胶质细胞分化增加，提示UCBMC通过Hedgehog/Wnt信号通路调控NSCs的分化。总之，UCBMC可通过Hedgehog/Wnt信号通路调控NSCs的增殖与分化。