经典Wnt通路在猪胰腺干细胞增殖和分化中的作用机理

胰腺干细胞（Pancreatic Stem Cells，PSC）是一类存在于胰腺组织的成体干细胞，是移植治疗糖尿病理想的种子细胞，然而PSC数量不足和诱导分化后细胞的胰岛素分泌水平较低是其临床应用中的一个瓶颈问题。经典Wnt通路在多种干细胞增殖分化过程中起重要调控作用，但在PSC增殖和向胰岛素分泌细胞分化及分化后的胰岛素分泌细胞增殖中的作用还不清楚。本研究拟在已有基础上，向猪PSC中转染pTRE-Dual-Wnt3a/AcGFP，建立强力霉素(doxycycline，DOX)可调控表达Wnt3a的细胞株，检测Wnt3a的表达对PSC增殖分化和分化后的胰岛素分泌细胞增殖及通路下游靶分子表达的影响，揭示其对猪PSC增殖和分化的调控机制，并将胰岛素分泌细胞进行体内移植实验，通过DOX诱导移植后细胞表达Wnt3a以研究长期治疗效果，为临床上以PSC作为种子细胞治疗糖尿病等胰腺相关疾病提供理论基础。

本项目在本研究团队已有基础上，向猪PSC中转染pIRES2-AcGFP1-Wnt3a真核表达载体，检测其对猪PSC细胞增殖及凋亡的影响；另外通过外源加入小分子抑制剂BIO，检测其对猪PSC增殖及向胰岛素分泌细胞分化的作用；此外，向猪PSC中转染TRE-Dual-Wnt3a/AcGFP，建立强力霉素(doxycycline，DOX)可调控表达Wnt3a的细胞株，检测Wnt3a的表达细胞增殖及通路下游靶分子表达的影响，揭示其对猪PSC增殖的调控机制；除此之外，我们还探索了小分子Conophylline对猪PSC、胰岛细胞团细胞的增殖及向胰岛细胞团诱导分化的作用及机理，所取得的主要研究进展和成果如下：.1.体外添加1µmol/L BIO后，可通过Wnt-βcatenin信号通路促进猪PSC的增殖，但对其向胰岛素分泌细胞分化的过程中无显著效用，说明BIO能够保持猪PSC未分化的状态。.2.通过构建Wnt3a的真核表达载体，并将其转染入猪PSC中，发现其可促进细胞增殖，并且可以抑制细胞的凋亡，这种效应是通过激活经典Wnt信号通路，由此激活下游关键靶基因的转录而引起，这对体外维持猪PSC的状态及数量具有重要意义。.3. 通过向猪PSC转入Tet-on系统的诱导表达载体和调控表达载体后，成功构建Dox诱导Wnt3a表达的猪PSC，并证明Wnt3a的表达受Dox处理时间和剂量调控，通过向细胞中添加Dox后，发现细胞增殖可明显增强，这些效应是通过Wnt3a的表达而引起。该系统的成功建立，将为我们后续研究Wnt通路在猪PSC增殖及分化机理提供一个实时动态的检测平台。.4. 我们通过实验证明，小分子Conophylline可促进猪胰腺干细胞、胰岛细胞团细胞的增殖，这种作用是通过PI3K通路介导的，这为提高猪PSC向胰岛素分泌细胞分化效率提供了一条新的途径。.5. 我们还构建了小鼠R-spondin1真核表达载体，并对其进行鉴定，将其瞬时转染到HEK-293细胞系中检测其表达，为进一步研究Wnt信号通路在猪胰腺干细胞中的作用机制奠定基础。. 本项目全面完成预定研究内容，实现了预期研究目标。共发表5篇SCI论文，国内核心期刊1篇；协作培养硕士生1名、博士生1名，在读硕士生2名；参加国际学术会议1次，国内学术会议2次，并作口头报告1次。