亚致死金黄色葡萄球菌冷冻胁迫耐受相关基因的发掘

Henan province is the leading province of frozen food industry in China, whereas, the most commonly detected Staphylococcus aureus causes serious food safety issues for frozen food. According to our previous studies, many S. aureus cells could keep alive for a long period although having suffered sublethal injury, which was presumed to be closely related with the expression of certain genes. In present research project, as compared with non-stressed cells, the whole genome expression profile gene chip combined with realtime PCR and 2 D polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) combined with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI TOF/TOF) assays will be employed to take following research, respectively: 1, the differentially transcriptional expression characterization of sublethal S. aureus under frozen stress; 2, the differentially proteome expression characterization of sublethal S. aureus under frozen stress, which is aimed to explore the frozen resistance related genes. The research results will not only be helpful to enrich the theories of sublethal effect and stress resistance of foodborne pathogens, reveal the molecular mechanism of S. aureus during resistance to frozen stress from the perspective of related genes expression, but also offer a theoretical basis for the establishment of efficiency and security food safety control technology of S. aureus in frozen food.

河南省是我国冷冻食品产业第一大省，金黄色葡萄球菌在冷冻食品中屡有检出，严重影响人们的食用安全。本项目组前期研究结果发现，冷冻胁迫下金黄色葡萄球菌细胞受到明显的亚致死损伤，但仍能够存活相当长时间，并推测与相关基因的表达调控密切相关。本项目将以未受冷冻胁迫细胞为对照，采用全基因组表达谱基因芯片结合Realtime PCR技术、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-D PAGE）结合MALDI串联飞行时间质谱（MALDI TOF/TOF）技术，重点研究：①冷冻胁迫下亚致死金黄色葡萄球菌转录组差异表达谱；②冷冻胁迫下亚致死金黄色葡萄球菌蛋白质组差异表达谱，从而发掘冷冻胁迫耐受相关的基因。本项目研究结果不仅能够丰富食源性致病菌亚致死和胁迫耐受理论，为从相关基因表达调控的角度揭示金黄色葡萄球菌冷冻胁迫耐受机制奠定基础，也能够为冷冻食品中金黄色葡萄球菌控制技术的建立提供理论依据。

在冷冻条件下，食源性致病菌常常处于亚致死损伤状态，并且能够在适当条件下通过对损伤关键部位进行修复而回复为正常状态，为冷冻食品安全带来严重隐患。本项目以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为对象，首先研究了冷冻贮藏、反复冻融和模拟冷链流通条件下金黄色葡萄球菌的总活性细胞数目，未受损细胞数目以及亚致死率的变化，并分别用线性、Weibull和修正的Gompertz模型对其进行拟合，建立的动力学模型不仅可预测冷冻食品中某一特定温度和时间下金黄色葡萄球菌污染的水平，也可以对其亚致死状态进行预测；采用表面衬托有γ-氨基丙基硅烷的Corning® UltraGAPSTM基片，对各种参数进行系统优化，建立了致病菌基因表达和检测的最佳基因芯片制作及分析方法，并在新鲜肉类样品中试用；测定了-18℃冻藏条件下金黄色葡萄球菌亚致死及生理指标的变化规律，探究其冷冻亚致死及耐受机制，结果表明，在冷冻初期正常金黄色葡萄球菌由于低温环境造成的细胞结构损伤导致死亡，而90 d后存活的亚致死细胞可以抵御冷冻胁迫，维持细胞形态及代谢；随后采用转录组测序技术（RNA-seq）高通量分析技术结合实时荧光定量（Realtime PCR）技术验证的方法对比分析了亚致死和对照细胞的全基因组转录信息，筛选出47个差异表达基因，说明这些基因与亚致死金黄色葡萄球菌冷冻胁迫耐受密切相关，亚致死细胞在冷冻胁迫下可通过多种基因的协同调控作用，形成冷冻胁迫耐受的分子调控网络；本研究也分析了冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌在适宜条件下修复的分子机制，结果表明冷冻致亚致死损伤的金黄色葡萄球菌修复过程中，可能是通过细胞膜完整性的修复，细胞恢复对高盐胁迫的抵抗能力；通过基因调控降低细胞内活性氧（ROS）的含量，降低活性氧对细胞的毒害作用。同时通过产能代谢相关基因的调控为细胞提供修复所需要的能量，最终冷冻致亚致死损伤的细胞得到修复；采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术比较分析了亚致死细胞修复启动过程中的差异蛋白质组表达谱，分析鉴定出了118个差异表达显著蛋白，其中表达上调45个，下调73个。总之，本项目研究结果建立了冷冻条件下金黄色葡萄球菌亚致死及失活模型，并从细胞形态、生理及基因表达调控的角度揭示了其冷冻胁迫耐受的分子机制，为冷冻食品中致病菌安全检测与控制技术的建立提供了理论依据。