筛选铱(Ⅲ)配合物作为G-四链体DNA的发光探针及对切刻核酸内切酶活性检测的应用

Transition metal complex-based luminescent probes have attracted considerable research interest for their potential biomedical applications. Ir(Ⅲ) cationic complexes of type [Ir(C^N)2(N^N)]+ not only possess high quantum yields, large Stokes shifts, long phosphorescence lifetimes and tunable emission colors depending on their ligands, but also have emissive behaviors that are highly sensitive to subtle environmental changes. Therefore, these complexes are attractive as probes for various analytes. Meanwhile, nicking endonuclease is a widely-used enzyme in molecular biology research, and has broad application in interdisciplinary research fields. In this project, we propose to establish a luminescent platform based on label-free G-quadruplex-selective Ir(Ⅲ) probes for the detection of nicking endonuclease activity. Firstly, a library of novel Ir(Ⅲ) complexes will be designed and synthesized. The relationship between their structures and their selectivity will then be studied through screening experiments. Subsequently, the structures of the Ir(Ⅲ) metal complexes will be further optimized. A criterion for screening of G-quadruplex selective probe will be also set up. Based on the best G-quadruplex-selective iridium(Ⅲ) probe, a simple, economical, operator-friendly and label-free detection platform for nicking endonuclease activity will be established. The assay will be optimized to achieve the most sensitive detection of nicking endonuclease activity. We will also investigate the application of the probe for the high-throughput and real-time detection of nicking endonuclease activity in real samples in a 96-well plate format.

过渡金属配合物作为发光探针已经得到越来越多的关注。铱(Ⅲ)阳离子型配合物[Ir(C^N)2(N^N)]+，不仅发光效率高，斯托克位移大，磷光寿命长和发光颜色可调等特点，而且其发射光谱对所处环境的微小变化敏感，这些特征使得它们非常适合于作为各种分子的发光探针。切刻核酸内切酶在分子生物学研究中具有极其重要的地位，在许多研究领域有着广泛的应用。本项目拟使用具有G-四链体选择性的铱(Ⅲ)配合物作为发光探针，建立基于G-四链体DNA的无标记检测平台来检测切刻核酸内切酶活性。首先建立铱(Ⅲ)配合物数据库，开发合成具有G-四链体选择性的铱(Ⅲ)探针。在筛选探针的同时，制定筛选G-四链体探针的标准。其次，在筛选出具有选择性的铱(Ⅲ)配合物的基础上，建立一个简易、经济且易于操作的切刻核酸内切酶活性检测平台。最后，将此平台与96孔酶标板结合，实现高通量实时检测平台的建立，达到实际样品应用性检测的最终目的。

切刻核酸内切酶在分子生物学研究中具有极其重要的地位，在许多研究领域有着广泛的应用。铱(Ⅲ)配合物作为新型的DNA发光探针，拥有不可替代的优良性质，如发光效率高，斯托克位移大，磷光寿命长和发光颜色可调，而且其发射光谱对所处环境的变化敏感等，这些特征使得它们已经成为近年来不同领域学者研究的热点。本项目首先利用本研究组已筛选的铱(Ⅲ)配合物G-四链体探针总结其规律性，设计和合成一系列新的铱(Ⅲ)配合物。其次，通过对铱(Ⅲ)配合物与G-四联体之间的相互作用进行计算机模拟，设计引入DNA沟槽识别的功能化基团，实现合成难度高的铱(Ⅲ)配合物与功能基团的链接，结果表明铱(Ⅲ)配合物对G-四联体的环形区域（loop）有偏好性。因此，我们进一步对合成的配合物的数据库进行筛选优化，建立了一个筛选G-四链体选择性探针的标准，并筛选得到一个最佳检测探针1。我们使用已筛选出的探针1来建立基于G-四链体的无标记检测平台，实现切刻内切酶Nb.BsmI的检测。实验结果表明，该探针对切刻内切酶Nb.BsmI的检测具有较好的选择性，在切刻内切酶Nb.BsmI浓度范围为0–10 U/mL内具有线性检测响应，最低检测限可达到0.042 U/mL。最后，此检测平台还成功应用于细胞提取液实际样品的检测。另外，基于切刻内切酶Nb.BsmI无标记检测平台的开发经验，我们进一步扩充铱(Ⅲ)配合物库并优化铱(Ⅲ)配合物化学结构，最终筛选得到探针2-12。实验结果表明，单一的Nicking酶或EXOIII酶可辅助放大检测平台中检测信号，Nicking酶辅助的核酸放大反应的灵敏度很明显高于EXOIII辅助的核酸放大的灵敏度。通过同时结合Nicking酶和EXOIII酶的放大效应，我们建立了一个基于核酸四面体结构的、对检测底物MUC1具有更好选择性和更高灵敏度的检测平台，MUC1在0.3 μM到30 μM浓度范围内呈现出浓度依赖线性响应关系，并达到最低检测限为0.13 μM。通过与传统的检测平台比较，我们发现构建所得的这个基于TNS片段的四面体检测平台比传统基于双链DNA片段的检测平台的信号输出增加了57%，这比传统的双链核酸检测平台具有更加显著的优势。