小菜蛾上DNA引导的基因抑制及机理初探

There are few studies on DNA interference (DNAi) in organisms, and even less in insects. Research on DNAi may provide more understanding on cell defense against exotic nucleic acid and a strong tool for gene regulation and gene silencing. Based on the previous study, the DNA sequences targeting bursicon gene (PxBursα) and arginine kinase gene (PxAK) in diamondback moth (DBM), Plutella xylostella and leading to a significant DNAi effect will be selected and used in this study. The effects of the length of DNA fragment, the modification in the 5’ end of DNA fragment, the quantity of DNA injected into the DBM larva and DNA ingestion by DBM larvae on DNAi phenomenon will be explored to further clarify the characteristics of DNAi in DBM. The cleavage of targeted mRNA by PxAgo guided by DNA will be examined in vitro and the cleavage site in mRNA will be determined. The effects of increased and decreased PxAgo expression on DNAi will be examined in DBM by using DBM lines with PxAgo expression increased and DBM lines with PxAgo expression decreased. In conclusion, the research will further clarify the characterization of DNAi in DBM and to reveal the role of PxAgo in DNAi at the first time to expand the research field of DNAi. In the meantime, the research will help develop new nucleic acid agents for controlling DBM and provide new theory and approach for pest control in general.

目前对生物体上DNAi现象的研究还比较少，关于昆虫DNAi的研究更少。DNAi的研究将有助于理解生物对外源核酸的防御和生物进化，同时为基因调控和沉默提供一个强有力的工具。我们将利用针对小菜蛾鞣化激素和精氨酸激酶基因，课题组已经筛选出DNAi效应好的DNA片段，进一步研究DNA片段长度、DNA片段5’端修饰、DNA片段浓度对DNAi效应的影响，以及喂食DNA方式能否导致小菜蛾DNAi效应。在明确小菜蛾DNAi现象的基础上，通过体外测定PxAgo在DNA引导下对RNA的切割功能和切割位点，以及在小菜蛾体内增强PxAgo表达和抑制PxAgo表达对DNAi效率的影响，明确PxAgo在DNA引导的基因沉默中的作用。研究结果将首次进一步明确昆虫的DNAi特征，并首次探讨PxAgo在DNAi效应中的作用，填补DNAi研究的空白领域；同时有助于研发小菜蛾防治的新型核酸药剂，以及为害虫控制提供新理论和方法。

DNA干扰（DNA interference）是一种由同源性DNA引发的靶标基因沉默的现象。目前已在多种生物中报道这一现象。原核生物的DNAi是由Argonaute蛋白介导的，真核生物的DNAi机理则尚无具体报道。因此，本研究以小菜蛾Plutella xylostella为研究对象，以鞣化激素α亚基（Bursα）为靶标基因，探索不同DNA片段对小菜蛾靶标基因表达的影响，同时发掘小菜蛾Argonaute蛋白在DNAi中可能起到的作用，利用转录组学和蛋白质谱技术，寻找在DNAi中参与DNA绑定的蛋白。主要结果如下：.选取小菜蛾鞣化激素（PxBursα）基因为靶标，设计干扰序列并合成ssDNA或PCR产物。将其注射进小菜蛾四龄幼虫体内，观察蛹的死亡情况。结果发现小菜蛾蛹的死亡率可随ssDNA片段长度的延伸，及PCR产物浓度的提高而增加；而ssDNA的3'与5'端磷酸化对小菜蛾蛹的死亡率无显著影响。.以PxBursα为靶标，设计正义链，反义链，正反义链的混合物，以及双链结构的DNA片段，并以序列相同的ssRNA与dsRNA为对照。将上述片段分别以相同物质的量注射进小菜蛾四龄幼虫体内，观察蛹的死亡情况。结果发现注射dsDNA片段的小菜蛾蛹的死亡率明显高于正义链和反义链组。dsDNA、ssRNA和dsRNA处理组小菜蛾蛹Bursα的表达量显著低于单链DNA处理组。但饲喂处理的小菜蛾并未表现显著差异，可能是DNA/RNA进入小菜蛾体内时发生降解。.利用果蝇与家蚕Ago家族序列，以及小菜蛾数据库，采用RACE-PCR技术筛选并克隆小菜蛾Ago家族，共计4个基因，分别为PxAgo1、PxAgo2、PxAgo3和Pxpiwi。鉴定并分析PxAgo家族的序列信息，蛋白分子特征，系统进化树，以及时空表达模式。对小菜蛾3龄末幼虫进行DNA干扰后取样，未发现PxAgo的表达量与对照组间表现显著差异。PxAgo可能不与DNA guide发生直接作用。.利用DNA Pull-down中的蛋白序列信息，初步筛选出参与DNAi过程中与DNA结合的蛋白。经搜库比对，裂解孵育处理组共拉取到248个蛋白，转染孵育处理组则为186个。两个处理组剔除对照后取交集有5个蛋白，取并集有197个，若两处理组直接取交集则有48个。并对上述交集与并集分析GO、KEGG和Pfam结构域特征，锁定部分可能参与DNAi的蛋白。