植物乳杆菌对仔猪小肠黏膜NK细胞免疫屏障功能的调控机制研究

Post-weaning diarrhea poses severe threat to the heath and growth performance of piglets. Lactobacillus Planttarum has been proven to be significantly effective in improving intestinal mucosal barrier integrity and function of young piglets, but the underlying immunological mechanism remains to be clarified. The present research aims to study the effect and underlying molecular mechanism of Lactobacillus Planttarum LP regulating immune barrier function of mucosal Natural Killer (NK) cells of young piglets . The following studies will be performed: (1) the role of mucosal NK cells in constraining inflammation and protecting intestinal epithelial cell; (2) effect of Lactobacillus Planttarum LP on regulating the immune barrier function of NK cell; (3) analyze the signal pathways through customized array, verify the target genes and proteins raised above using RT-PCR, western-blot and Antibody blocking technologies. The study will contribute to understanding the characteristics of the innate immune system in intestinal mucosa of piglets, as well as the interactions between the immune system and gut microbes, and to provide theory basis for the nutrition regulation of disease prevention and intestinal health in young piglets.

断奶腹泻是制约养猪生产的瓶颈问题。植物乳杆菌显著改善幼龄仔猪肠黏膜屏障完整性和功能，但其免疫学机理仍有待探明。本项目拟以体外培养的仔猪肠黏膜NK细胞为主要研究对象，采用细胞/细菌（共）培养、流式细胞术、免疫组化等研究手段和方法，（1）研究NK细胞在肠上皮细胞完整性和活力的维持及损伤修复过程中的作用，明确其免疫屏障功能；（2）研究植物乳杆菌LP及其细胞壁成分（磷壁酸、多糖、肽聚糖）对NK细胞免疫屏障功能的影响；（3）采用功能分类基因芯片分析LP调控NK细胞功能的主要信号通路，并通过RT-PCR、western-blot和抗体阻断技术对相关信号通路关键靶点进行验证，最终揭示LP调控肠黏膜NK细胞免疫屏障功能的分子机理。研究结果将有助于认识仔猪肠黏膜固有免疫的特征及其与肠道微生物的互作关系，为仔猪疾病预防和肠道健康的营养调控提供理论依据。

植物乳杆菌显著改善动物肠道黏膜屏障功能和免疫机能，有效预防大肠杆菌性腹泻的发生，但其作用机理尚不清楚。自然杀伤性细胞（natural killer cell，NK）是人和动物固有免疫的主要承担者，其显著促进肠黏膜上皮细胞增殖分化并抑制其凋亡，修复受损上皮细胞的功能。为了阐明植物乳杆菌改善肠道健康的免疫学机理，本项目重点围绕植物乳杆菌对幼龄仔猪肠黏膜免疫屏障功能，特别是NK细胞免疫功能的调控及其分子机制展开研究。采用体外细胞-细菌共培养方法研究发现，植物乳杆菌显著提高正常培养的IPEC-1细胞pBD-1及抗炎因子PPAR-γ mRNA的相对表达水平；显著提高IPEC-1细胞黏蛋白MUC-1和MUC-4的基因相对表达水平；显著降低由ETEC K88诱导的IPEC-1细胞炎症因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α的基因表达；植物乳杆菌抑制由大肠杆菌K88诱导的小肠上皮细胞炎症反应的作用机理是通过抑制MAPKs及NF-κB信号通路的激活，尤其是JNK和NF-κB的激活而抑制炎症因子的表达，降低细胞炎症反应水平。值得注意的是，上述结果均为植物乳杆菌的预防效应；植物乳杆菌对已感染大肠杆菌的肠上皮细胞损伤无显著治疗/修复作用。因此，本项目进一步研究了植物乳杆菌对先天免疫细胞NK细胞功能的调控作用。研究结果表明，植物乳杆菌显著提高NK细胞表面特征性因子NCR2和NCR3的蛋白表达水平，促进NK细胞活化并表达合成在黏膜细胞的损伤修复过程中发挥重要作用的细胞因子IL-22。植物乳杆菌显著提高NK细胞中TLR2的mRNA和蛋白表达水平。将植物乳杆菌处理过的NK细胞与NCM460共培养后，显著促进ETEC感染的NCM460细胞Tyk2和Stat3的磷酸化水平，提高NCM460细胞的紧密连接蛋白表达水平，修复由ETEC K88引起的NCM460细胞TEER的降低，并且这种修复作用主要通过IL-22介导。综上，植物乳杆菌可通过促进小肠上皮细胞表达抗炎细胞因子，改善NK细胞免疫功能并抵御大肠杆菌侵染引起的肠上皮细胞损伤，从而维护肠黏膜免疫屏障功能的完整性。本项目研究结果为益生菌对幼龄动物免疫功能的调控作用，特别是为乳杆菌的工业化应用提供了理论依据。