MBNL3诱导的长链非编码RNA-PXN-AS1可变剪切在TGF-β抑癌过程中的作用及机制研究

Transforming factor-β (TGF-β) promotes tumor progression in the late stage of cancer. But in the early stage TGF-β inhibits tumor formation. Although the oncogenic roles of TGF-β are thoroughly understood, the tumor suppressing roles and its downstream mediators are largely unknown. Using gene expression microarrays, and combining experiment methods of molecular biology and tumor biology, we acquired an important molecular-splicing factor MBNL3, which mediating the tumor suppressing roles of TGF-β. Using high-throughput transcriptome sequencing, we acquired an important splicing event of long noncoding RNA-PXN-AS1. MBNL3 induced the inclusion of an exon on lncRNA-PXN-AS1. Our preliminary results shown that the long transcript of lncRNA-PXN-AS1 promoted tumor progression, but the short transcript didn't have tumor biology roles. In this study we will further focus on the different tumor biology roles of lncRNA-PXN-AS1 in the process of tumor suppressing of TGF-β, the underlying molecular mechanisms, and its clinical significance. This study will recover alternative splicing of lncRNAs, a new gene expression modulating manner, and deepen the understanding of transcriptome complexity. The purpose of this study is to provide a new visual angle to understand tumor biology roles of TGF-β and the progression of tumor, and also provide new targets for tumor preventing and therapy.

TGF-β在肿瘤晚期可促进肿瘤的进展，在肿瘤发生的早期又可抑制肿瘤形成。目前对其促癌作用的研究较深入，但对其抑癌作用，特别是介导其抑癌作用的下游分子的认识尚不清晰。利用基因表达芯片结合分子生物学、肿瘤生物学实验手段，我们筛选到介导其抑癌作用的关键分子—剪切因子MBNL3。利用全转录组深度测序，我们筛选到MBNL3诱导的关键可变剪切事件—lncRNA-PXN-AS1上一个关键外显子的外显或内含，其可变剪切生成两种不同的转录本，而这两种转录本具有完全不同的生物学功能。因此本课题拟进一步研究lncRNA-PXN-AS1可变剪切所产生不同转录本在TGF-β抑癌过程中的差异生物学作用，其差异作用的下游分子机制及其可变剪切的临床意义；揭示lncRNA可变剪切这一基因表达调控的新方式，加深对转录组复杂性的认识；为全面理解TGF-β的生物学作用及肿瘤发生发展提供一个新的视角，也为肿瘤的防治提供全新的靶点。

可变剪接可使同一基因产生不同的转录本，丰富了转录组和蛋白质组的多样性。异常的可变剪接在肿瘤发生发展过程总发挥着重要作用。在本课题的资助下，我们重点研究了引起异常可变剪接的剪切因子MBNL3。发现剪切因子MBNL3在胎肝中高表达，在肝癌组织中也显著高表达。预后分析，发现MBNL3的高表达指示着更差的病人预后，并且MBNL3的高表达是肝癌预后的独立危险因子。检测MBNL3的启动子区域，发现多个干性相关转录因子NANOG、OCT4、SOX2的结合位点，染色质免疫共沉淀实验证实NANOG、OCT4、SOX2确实可结合于MBNL3的启动子区域。在多个细胞系中发现过表达NANOG、OCT4、SOX2上调MBNL3的表达。功能学实验发现，过表达MBNL3促进肝癌细胞的增值，抑制肝癌细胞的凋亡，促进肝癌细胞的体内成瘤。而抑制MBNL3显著抑制肝癌细胞的增值，诱导肝癌细胞凋亡，显著抑制肝癌细胞的体内成瘤。表明MBNL3发挥着癌基因的作用。利用转录组测序，发现MBNL3可促进lncRNA-PXN-AS1第4位exon的保留，上调较长的转录本(PXN-AS1-L)的表达，而下调较短的转录本(PXN-AS1-S)的表达。体内外功能学实验结果表明PXN-AS1-L促进肝癌细胞的增值，抑制肝癌细胞的凋亡，促进肝癌细胞的体内成瘤。而PXN-AS1-S抑制肝癌细胞的增值，诱导肝癌细胞凋亡，显著抑制肝癌细胞的体内成瘤。MBNL3的促癌作用部分依赖于其对lncRNA-PXN-AS1可变剪切的调控作用。利用RNA免疫共沉淀、体外转录生物素标记的lncRNA、RNase保护实验，表明PXN-AS1-L、PXN-AS1-S都可结合PXN mRNA，但是PXN-AS1-L通过结合PXN mRNA的3’UTR，抑制miR-24-AGO2沉默诱导复合体对PXN mRNA的结合及对PXN mRNA的降解及翻译抑制作用，而上调PXN mRNA水平及表达；PXN-AS1-S通过结合PXN mRNA的CDS区，抑制翻译延长因子与PXN mRNA的结合，进而抑制PXN mRNA的翻译，下调其表达。表明PXN-AS1-L上调PXN的表达，PXN-AS1-S抑制PXN的表，而促进肝癌细胞增殖，抑制肝癌细胞凋亡。该研究表明癌胚剪切因子MBNL3通过诱导lncRNA-PXN-AS1的可变剪切，显著上调PXN的表达，增强肝癌致瘤性。