PLGA纳米球吸附MHC同种抗原和负调节分子诱导皮肤移植耐受的研究

选择性清除或抑制抗原特异性T细胞是治疗移植排斥和自身免疫病的理想策略之一。在已有研究基础上，本项目拟用可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米球及微米球做载体，吸附H-2Kb抗原和anti-Fas、PD-L1.Ig及TGF-b1等三种负调节分子，在皮肤移植鼠体内通过多信号通路和多种机制对同种反应性T细胞诱导更强更久的抑制效应。本项目以MHC抗原中只有H-2Kb不同的C57BL/6鼠和bm1鼠做皮肤移植的供受体，用BALB/c鼠做第三方供体，同时用绿色量子点和红色PE分别标记载体和H-2Kb抗原，利用活体或组织器官荧光成像示踪系统、激光共聚焦、细胞流式分析、免疫组化以及细胞的功能性检测等技术，系统研究该免疫调节性PLGA颗粒在皮肤移植鼠体内的有效治疗方案、时空分布、对各种免疫细胞的作用机制、毒副作用以及对机体整体免疫功能的影响，为移植排斥、自身免疫病等提供一种新的可行的特异性免疫疗法。

选择性清除或抑制抗原特异性T细胞是治疗移植排斥和自身免疫病的理想策略之一。本项目用可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA) 微米球及纳米球做载体，共吸附H-2Kb同种抗原和anti-Fas、PD-L1.Ig及TGF-β1等负调节分子，制备杀伤性PLGA生物制剂，治疗以C57BL/6鼠和bm1鼠为供受体的皮肤移植排斥，并进行机制性探讨。主要结果如下：1、经3次尾静脉输注，直径4.5μm的杀伤性PLGA-MPs使皮肤移植物存活期延长41天；2、主要机制是H-2Kb分子靶向的、anti-Fas介导的同种反应CD8+ T细胞凋亡，使其在外周血、脾脏和移植物局部大量较少，并诱导淋巴结的Treg增加，而AICD效应不明显；3、治疗对脾脏和外周血中其他免疫细胞群体的数量（CD4+ T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞、中性粒细胞）没有明显影响；4、对受者鼠整体免疫功能如抗肿瘤能力、CD3+ T细胞对第三方脾细胞的同种增殖能力、NK细胞体外杀瘤能力等没有明显抑制；5、杀伤性PLGA-MPs在受体鼠内主要积累于肝、肺、脾和肠道等组织器官，并滞留24-36小时；6、共包被H-2Kb和anti-Fas的杀伤性PLGA-NPs（直径200nm）经尾静脉3次输注后能使bm1鼠的皮肤移植物存活期延长19天；共包被H2-Kb 靶抗原和三种负调节分子（Anti-Fas+ +TNFβ+PDL-1）的PLGA-NPs则能使移植物存活期延长24天；但直径450nm的杀伤性PLGA-NPs治疗效果不明显；7、杀伤性PLGA-NPs在体内的杀伤机制包括Anti-Fas介导的凋亡、AICD以及通过TNFβ和PDL-1等信号通路的免疫抑制作用等。上述结果首次证实了杀伤性PLGA-MPs或NPs能在体内选择性地杀伤同种抗原特异性T细胞，使移植物存活期明显延长且不影响整体免疫功能，为移植排斥和自身免疫病的治疗提供了新的特异性免疫治疗策略。计划外的工作：1、研究了杀伤性PLGA-MPs在体外和OT-1转基因鼠体内均能高效地、特异性地杀伤OVA抗原特异性CD8+ T细胞克隆及其机制；2、建立了一种同步检测抗原特异性T细胞数量和反应活性的新方法，即磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板技术（aAPC-microplate），证实其具有较高的特异性、准确性和重复性以及与传统的pMHC多聚体荧光流式分析法的高度相关性。