miR-27a调控Litaf在胆绿素治疗大鼠脑缺血-再灌注损伤中的作用及机制研究

Inflammation plays an important role in the occurrence and development of cerebral ischemia reperfusion injury（CIR）. Biliverdin (BV) has anti-inflammatory effects in many diseases, but is mechanism of CIR as poorly know.Our previous work suggested that:1. Biliverdin administration ameliorates CIR in rats may associated with the downregulation of proinflammatory factors;2.After experiencing CIR, the expression of miR27a was upregulation and the expression of Litaf was downregulation,while afting biliverdin administrating the expression of Litaf and miR27a were on the contrary.While its mechanism needs to be further explored. So we hypothesized that,the signaling pathway that BV regulates miR27a and its downstream target gene Litaf may explain the mechanism of cerebral protection for BV during CIR.To verify this hypothesis, we will use PC12 cell line ,rat primary cortical neurons,and rats cerebral ischemia reperfusion injury (tMCAO) model, adapt bioinformatics, Tunel staining, RNA interference, Western blot, qPCR to explore the importance role of miR27a in CIR from the molecular, cellular, tissue, and the overall level of animals.This study will provid new insight into understanding the process of BV administration ameliorates CIR in rats.

炎症反应在脑缺血-再灌注损伤（CIR）的发生发展中发挥了重要作用。胆绿素(BV)在许多疾病发生发展过程中能发挥抗炎作用，但其在CIR病理生理过程中的作用及机制仍知之甚少。前期研究发现：1.BV治疗大鼠CIR后有脑保护作用，缺血侧脑皮质炎症因子释放减少；2生物信息软件预测miR27a的靶基因包含Litaf,CIR后miR27a表达上调，胆绿素治疗后miR27a表达下调；Litaf变化趋势与miR27a相反。为此，我们提出假说：BV脑保护作用与BV调控miR27a及下游Litaf基因信号通路有关。为验证这一假说，我们将通过PC12细胞株、大鼠原代皮质神经元、大鼠脑缺血-再灌注模型，采用生物信息学，Tunel染色，基因克隆，RNA干扰，WB，qPCR等手段从分子、细胞、组织以及动物整体水平等探讨miR27a在CIR中的重要作用，明确miR27a通过调控Litaf抑制炎因子释放的机制。

脑缺血-再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury, CI-RI）是继发于缺血性脑卒中的一种严重的脑组织损伤，其机制复杂且尚未完全阐明。胆绿素（Biliverdin, BV）已被证实在许多疾病及缺血/再灌注损伤事件中具有抗炎和抗凋亡等保护作用，但在CI-RI中的作用及其机制尚不清楚。本项目在前期miRNA芯片发现胆绿素引起miR-27a-3p差异变化及预测Litaf可能为其靶基因的基础上，通过细胞和大鼠建立CI-RI模型，采用生物信息学，Tunel染色，基因克隆，RNA干扰，WB，qPCR等手段从分子、细胞、组织以及动物整体水平等进一步明确胆绿素的作用，探讨miR-27a-3p在CI-RI中的重要调控作用，以及明确miR-27a-3p通过调控Litaf发挥相应作用的机制。体外研究表明，胆绿素显著提高了CI-RI后的细胞活力，降低了细胞的凋亡率，抑制了炎症和凋亡相关标志物的表达，上调了miR-27a-3p的表达；过表达miR-27a-3p同样能抑制CI-RI后的炎症反应和细胞凋亡，而敲低miR-27a-3p表达的作用则与之相反；此外，双荧光素酶报告基因实验证实了Litaf为miR-27a-3p的直接靶点，miR-27a-3p能靶向抑制Litaf的表达；敲低Litaf的表达能产生与过表达miR-27a-3p同样的抗炎和抗凋亡的作用，同时也能够逆转敲低miR-27a-3p表达所产生的效应。体内研究表明，胆绿素降低了CI-RI后的脑梗死体积和缺血侧脑组织中炎症因子的表达。机制上，通过生物信息学分析和验证发现，miR-27a-3p在此过程中发生差异表达，胆绿素上调了miR-27a-3p的表达。miR-27a-3p通过靶向抑制Litaf的表达改善了CI-RI大鼠的神经功能缺损，降低了脑梗死体积和脑组织含水量，降低了炎症因子IL-6的表达，降低了凋亡细胞的数量和凋亡相关蛋白的表达；此外，miR-27a-3p还能够负调控TLR4/NF-κB通路来抑制CI-RI后的炎症反应。综上，本研究探索了胆绿素对CI-RI的抗炎和抗凋亡的保护作用，首次阐明了miR-27a-3p通过靶向调控Litaf和负向调控TLR4/NF-κB通路参与胆绿素作用的机制。因此，本项目具有重要的理论意义和临床指导意义，为脑缺血-再灌注损伤的预防与治疗提供了坚实的理论依据。