LncRNA-Kcnq1ot1与印记基因互作的表观遗传学机制及其与猪胎儿骨骼肌发育的关系

Long noncoding RNA (LncRNA) Kcnq1ot1 and its regulation of adjacent imprinted genes which affect mammalian embryonic development is one of reseach hotspots in LncRNA reseach fields, recently. The documented evidence showed that it is rather more complicated and is in the scale for the gene structure and spatio-temporal expression filing of Kcnq1ot1 gene and the interaction mechansim of Kcnq1ot1 with related imprinted genes. The investigation of these issues in porcine is lagging compared with this study in human and mouse. Based on our previous reseach on pig Kcnq1ot1 gene, in this project, we are going to clone and identify the gene structrue and functional sequences of pig Kcnq1ot1 gene by utilizing comparative genomics and bioinformatics methods, detect its expression and regulation pattern by using DNA methylation sequencing and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), analyse the interaction between Kcnq1ot1 gene and related imprinted genes and KvDMR in Kcnq1 gene and eveluate their effects on pig fetal skeletal muscle development by RNA interferece (RNAi), Chromatin Conformation Capture (3C) or RNA-3C and DNA/RNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) techniques and others. The results will uncover the molecular feature of LncRNA Kcnq1ot1 gene and the Epigenetics mechanims of Kcnq1ot1 RNA silence the relatd imprinted genes, and provide the theoretic basises and techniques insistance for finding novel gene resources with national intellectual property.

长非编码RNA (LncRNA) - Kcnq1ot1及其调控印记基因从而影响胚胎发育是近几年的一个研究热点。现有证据表明人和小鼠Kcnq1ot1基因结构、时空表达及其与相关印记基因的互作关系非常复杂，至今悬而未决。猪胎儿骨骼肌发育相关Kcnq1ot1基因的分子特征、自身表达及其沉默印记基因的表观遗传学机制更是不甚了了。在前期工作的基础上，本项目拟利用比较基因组学和生物信息学技术克隆与鉴定猪Kcnq1ot1基因序列结构与特征，应用甲基化测序和ChIP技术鉴定其自身表达与调控模式，应用RNAi、染色质构象捕获技术（3C和R3C）和DNA/RNA FISH等技术解析其与相关印记基因的互作关系及其对猪胎儿骨骼肌发育的影响。力图揭示猪LncRNA-Kcnq1ot1的分子特征及其沉默相关印记基因的表观遗传学调控机制，为改良猪生长发育性状提供具有我国自主知识产权的基因资源和技术支持。

长非编码RNA(lncRNA)-Kcnq1ot1及其调控印记基因可能对猪胎儿骨骼肌发育具有十分很重要的作用。本项目利用比较基因组学、生物信息学技术克隆并鉴定猪Kcnq1ot1基因序列结构和特征，通过qPCR技术在猪不同组织及骨骼肌卫星细胞中对Kcnq1ot1基因进行了表达规律分析，并利用RNA沉默技术敲除Kcnq1ot1基因并检测了其对卫星细胞的作用。试验获得如下结果：试验通过Touch down PCR和巢式PCR对Kcnq1ot1基因进行cDNA末端快速克隆技术（RACE），并成功获得Kcnq1ot1的3’端序列；Kcnq1ot1基因表达规律分析结果显示其在猪的各个组织中广泛表达，其在卫星细胞增殖过程中的表达量呈升高趋势，在卫星细胞分化过程中的表达量先上升后下降并且趋于稳定；Kcnq1ot1基因沉默后，卫星细胞增殖Marker基因 Pax3、Myf5基因极显著上调（P<0.05），而分化Marker基因MyHC极显著下调（P<0.05）；MyHC蛋白表达免疫荧光结果显示，Kcnq1ot1基因沉默后，MyHC蛋白表达水平下降。研究结果揭示了Kcnq1ot1基因对猪骨骼肌卫星细胞的增殖具有一定的抑制作用，而对卫星细胞分化具有促进作用。本研究为猪肌肉发育的表观遗传学调控提供了直接证据，为改良猪生长发育性状提供具有我国自主知识产权的基因资源和技术支持。