猪繁殖与呼吸综合征病毒膜蛋白GP3和GP4中和表位鉴定与功能分析

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) causes porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) with the symptoms of abortion and respiratory failure, which is one of the most severe infectious diseases in swine. Currently, the epitopes and their functions in the structural proteins of PRRSV are still unclear. Herein, GP3 and GP4 proteins of PRRSV will be expressed and used to generate monoclonal antibody (mAb) by hybridoma technique, respectively. These mAbs will be subjected to panning using phage display library, DNA extraction, PCR and sequencing to identify linear epitopes in PRRSV GP3 and GP4 protein. Neutralizing assays will be done to determine the neutralizing effect of the epitope peptides. Using plaque assays, immunofluorescences and real-time PCR, effect of the peptides on PRRSV infection and replication will be analyzed. In vivo anti-PRRSV activity of these peptides will be measured by inoculating piglets. The project provides important basis for understanding mechanisms regarding PRRSV infection and for developing anti-PRRSV small molecules.

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染导致的猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是以母猪流产和仔猪呼吸障碍为特征的危害养猪业最严重的传染病之一。目前有关其结构蛋白表位和功能尚不清楚。本研究拟通过体外高效表达PRRSV囊膜蛋白GP3和GP4，用杂交瘤技术制备和纯化这二种蛋白的单克隆抗体。用噬菌体肽库对GP3和GP4单抗进行生物淘选，结合噬菌体基因PCR和测序获得展示在噬菌体表面的PRRSV GP3和GP4蛋白的表位序列。病毒中和实验确定这些表位肽的中和活性。用病毒蚀斑实验、间接免疫荧光和定量PCR分析这些合成表位肽对PRRSV病毒感染和复制的影响。通过接种仔猪确定这些表位肽体内抗PRRSV感染的效力。本课题为了解PRRSV感染机理及开发抗该病毒的分子制剂奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染导致的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是以母猪流产和仔猪呼吸障碍为特征的危害养猪业最严重的传染病之一。PRRSV GP3和GP4糖蛋白作为其结构蛋白的生物学功能研究尚未见报道，其抗原表位的鉴定及其生物学功能研究具有重要意义。本研究首先原核表达了PRRSV GP3重组蛋白，纯化后免疫BALB/C小鼠制备了1株抗PRRSV GP3蛋白的单克隆抗体1F7。单抗腹水纯化后作为靶分子包被ELISA板，应用噬菌体随机肽库对其进行4轮淘选，获得了10个阳性噬菌体，测序结果为证明7个噬菌体序列一致为ATPLSSTTWLWR（Phage V）；这与PRRSV HH08株GP3氨基酸序列64-70位氨基酸有一定的相似度。噬菌体抗原竞争抑制试验和ELISA证实筛选出的噬菌体展示多肽的空间构象与天然抗原表位相似。间接免疫荧光技术和流式细胞术证明亲和肽Phage V具有很好的抗病毒活性。接着项目开展了GP4蛋白的表达和单克隆抗体的制备并获得1株抗PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体5F12，该株抗体的稳定性与特异性较好，不仅能够与重组GP4蛋白反应，而且能够与PRRSV有良好的反应性。应用噬菌体随机肽库进行4轮生物淘选，得到10株阳性噬菌体，测序后结果为10个噬菌体中有4个氨基酸序列相同，分别为AKFEVCSPVVLG、GVNQENMLHFSF、NPRIRLNFIRIG和SGVYKVAYDWQH，命名为phage I-IV。序列比对发现phage I和II的12肽序列分别与PRRSV HuN4株GP4蛋白第112至123位和第84至95位氨基酸序列具有很高的相似性。噬菌体竞争抑制试验与ELISA方法证实筛选出的亲和噬菌体与PRRSV及其GP4蛋白有很高的反应性。间接免疫荧光和实时荧光定量PCR检测证明Phage I、Phage II亲和多肽单独或者两种多肽联合与PRRSV作用均能有效的抑制病毒复制，其中Phage I抑制病毒作用强于Phage II，两种多肽联合作用的抗病毒效果比单独作用的效果更好。仔猪免疫保护试验表明GP3亲和噬菌体（Phage V）和GP4亲和噬菌体（Phage I）免疫均能诱导仔猪产生较好的免疫反应，与疫苗免疫组无明显统计学差异，都能保护仔猪TGEV强毒的攻击。