CD44与RAS通路对乳腺癌细胞EMT过程的协同调控研究

上皮-间质转化(EMT)是恶性肿瘤侵袭转移过程中的关键事件，RAS通路可诱导乳腺癌细胞EMT过程发生。我们前期工作证实：RAS通路可不经过受体酪氨酸激酶（RTK）通路直接诱导EMT的发生，且与HA刺激具有协同作用，期间伴有CD44表达升高，粘着斑激酶（FAK）磷酸化。结合文献报道和前期工作，申请者提出：在RAS通路诱导EMT过程中伴CD44表达上调，CD44与HA结合后又进一步促进RAS对EMT的诱导，这一过程可能经RAS依赖和FAK依赖两种途径完成，这样就形成一个CD44的正反馈循环，启动并维持EMT过程。本课题拟从RAS、CD44、FAK三个关键点入手，通过对关键蛋白活化/抑制的方法，检测下游信号通路的激活/阻断状态，进而证实该反馈循环的存在，并在乳腺癌组织标本中进行验证，初步阐明CD44在RAS诱导的EMT过程中的作用，对现有肿瘤转移机制做出补充和完善，并为抗肿瘤治疗提供新的思路。

本研究在课题组前期工作的基础上，结合肿瘤转移机制的研究热点以及临床治疗中存在的问题，研究TGF-β1和EGF通路对上皮间质转化以及肿瘤转移潜能这两个细胞生物学特性的作用，探讨通路的共同交叉分子CD44的作用机制，探讨ESRP-1对其它下游靶基因的调控作用机制以及产生的不同受体亚型分子的生物学作用，为靶向阻断抗肿瘤治疗提供新的思路。研究结果表明：.1. TGF-β1和EGF在肿瘤细胞的EMT过程中存在协同作用，在两者的共同作用下，肿瘤细胞上皮标志蛋白的表达量明显下降，而间质标志蛋白表达量显著增加，相应信号通路的下游靶点分子也明显激活。2. 相比较TGF-β1或EGF单独作用，二者同时作用，使细胞获得的间质特征更加明显，细胞的移动性增强，细胞的侵袭能力更显著，在联合使用二者的小分子抑制剂时，可以明显降低细胞的移动和侵袭能力。3. 在TGF-β1调节EMT过程中，发现透明质酸的受体CD44与EGF的受体EGFR存在共定位，并且HA-CD44通路在TGF-β1与EGF协同诱导EMT过程中发挥着关键性的作用。4. EMT的过程中，相关标志蛋白和转录因子均发生表达变化，尤其是ZEB1的表达上调，期间伴随上皮选择性剪切调节蛋白1（ESRP-1）的表达下调，且二者在变化时间上具有一致性。5. 转染了ZEB1-siRNA后，ZEB1蛋白的表达明显抑制，同时抑制了ESRP-1的表达下调；转染了ZEB1表达质粒后，ZEB1的表达量明显增多，从而导致ESRP-1的表达下降更加明显。6. EMT过程中，ESRP-1可以选择性剪切不同靶分子并产生不同的分子受体亚型，同时可以诱导不同的配体产生。7. 荧光素酶和CHIP实验表明：ZEB1可抑制ESRP-1的转录活性。.研究得到的结论：.1. TGF-β1和EGF在肿瘤细胞的EMT过程中存在协同作用；2. TGF-β1和EGF在肿瘤细胞的EMT过程中的协同机制与HA-CD44通路密切相关；3. EMT过程中，ZEB1可以转录调节抑制ESRP-1的表达，从而促进EMT过程；4. ESRP-1发挥选择性剪切作用来影响其靶基因，产生不同的受体亚型分子，对肿瘤的转移发挥重要作用。.研究成果：.在SCI收录期刊发表2篇论文，在中华系列及核心期刊发表6篇论文；培养研究生2名。