RNA结合蛋白对癌症相关microRNA簇miR-17-92转录后调控及癌症发生的机制研究

miR-17-92编码6个microRNA，是一个同时具有致癌和抑癌两种完全相反功能取向的基因簇。其致癌功能主要通过其编码的致癌microRNA（miR-19a/19b）下调两个肿瘤抑制因子Bim和Pten的表达来实现。同时其编码的抑癌microRNA（miR-17/20a）可以通过下调两个致癌基因AIB1和E2F1的表达，抑制癌症发生。所以致癌microRNA和抑癌microRNA的竞争性差异表达，决定了该基因簇表现为致癌还是抑癌。由于该基因簇位于同一个转录本上，因此这些表达差异是转录后调控的结果。本项目将在不同的细胞系内对miR-17-92的转录后调控进行研究，系统的鉴定在不同的转录后调控过程中发挥作用的蛋白因子，并对这些蛋白因子的调控机制进行研究，从而增进我们对microRNA转录后调控的认识，并为癌症的预防和治疗提供一个新的思路。

MicroRNA是一大类转录后调控基因表达的小非编码RNA，它们从初始转录本成熟为有功能的microRNA需要两步RNA酶III的加工，这些过程是受到严谨调控的，尤其是RNA结合蛋白的调控。miR-17-92编码6个成熟microRNA，这些来源于同一转录本的microRNA表达水平有显著差异。为了找到调控这些microRNA差异表达的决定因素，我们使用RNA亲和纯化的方法鉴定了与这六条microRNA差异结合的RNA结合蛋白。我们发现paraspeckle的三个蛋白组分（PSF、Nono和PSP1）都可以与miR-19a/b特异结合。敲除实验证明 PSF和Nono都可以稳定miR-19a/b的成熟水平，且paraspeckle的RNA骨架分子Neat I同样也可以稳定miR-19a/b的水平，暗示paraspeckle这个复合体可能调控miR-19a/b的表达。.miRNA-seq结果表明paraspeckle各组分对 miR-19a/b之外的众多microRNA的表达也是必需的，暗示一种广谱的调控机制。为了研究其调控机制，我们以miR-17-92簇的microRNA为研究对象，构建了报告系统检测细胞内microprocessor 的加工情况。结果表明Neat I、PSF和Nono对miR-17-92簇内microRNA的加工是必要的，这些因子的缺失导致pri-microRNA加工的显著下调。组合敲除实验表明 paraspeckle是作为一个整体调控microprocessor的功能。为了弄清其调控方式，我们通过免疫共沉淀来研究DGCR8与paraspeckle各组分的相互作用，结果表明paraspeckle的三个蛋白组分（paraspeckle proteins，简写为PSP，包括PSF、Nono和PSP1等）与DGCR8仅有微弱或者没有相互作用；而RIP-PCR和clip-seq结果都表明DGCR8与Neat I RNA有强烈的结合，同时免疫荧光表明DGCR8在paraspeckle上有显著的富集。这些结果暗示microprocessor在paraspeckle的定位可以促进其对部分microRNA的加工。