基于核酸适配体的循环肿瘤细胞实时克隆分型指导非小细胞肺癌EGFR-TKI药物二次应用的探索性研究

Epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have evident effect in non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients. However, most of the patients will eventually undergo progressive disease (PD) despite the initial response, and once PD was happened, the available treatment options of those patients became very narrow. We have reported previously that retreatment of EGFR-TKI can be considered as an option for those patients, and the dynamic changing of circulating tumor cell (CTC) which is sensitive to EGFR-TKI may provide assistance in rational re-administration of EGFR-TKI. Cooperating with the institute of chemistry, Chinese academy of sciences, we have found in our previous research that DNA aptamers could not only effectively enrich CTCs of NSCLC patients, but also recognize the subtypes of those cells. In this research, we will continue our cooperation. Using Cell-SELEX method, we are trying to select the DNA aptamers which could specifically recognize EGFR-TKI sensitive cells and resistant cells, respectively. After its function was verified in vitro, the selected DNA aptamers would be used in the CTC test of patients who received EGFR-TKI retreatment. We believe that the correlation analysis of the dynamic changing in EGFR-TKI sensitive CTC between curative effects of EGFR-TKI would provide reliable biomarker for the rational re-administration of EGFR-TKI. Meanwhile, our research is applicable for other drugs that beyond EGFR-TKI. Our research could help the physicians to fulfill better the individualized treatment to cancer patients and have good prospect in clinical application and academic value.

尽管EGFR-TKI在NSCLC患者中疗效显著，但患者耐药后的治疗选择非常有限。我们前期的临床研究发现， EGFR-TKI的二次应用是耐药患者可行的治疗方案之一，而EGFR-TKI敏感型CTC的动态变化将有助于指导其合理应用。我们前期与中科院化学所的合作研究显示，核酸适配体不仅可以有效富集NSCLC患者的CTC，还可将CTC区分为不同的克隆亚型。在本课题中，我们拟与中科院化学所继续深入合作，通过Cell-SELEX技术筛选分别与EGFR-TKI敏感细胞及耐药细胞特异结合的核酸适配体组合，体外验证其功能，进而将其用于EGFR-TKI二次治疗患者外周血的检测，分析EGFR-TKI敏感型CTC的动态变化与该药物疗效的相关性，为其合理的二次应用提供准确可靠的生物标记物。本研究对EGFR-TKI以外药物的合理使用也有借鉴作用，有助于更好的实现肿瘤患者的个体化治疗，具有良好的应用前景和学术价值。

尽管EGFR-TKI在NSCLC患者中疗效显著，但患者耐药后的治疗选择非常有限。既往的研究表明，通过液体活检进行EGFR的实时检测有望在患者的治疗全程之中更好的指导TKI药物的使用。在本课题中，我们主要针对液体活检的两种重要材料来源，即循环肿瘤细胞（CTC）和游离肿瘤核酸（ctDNA）进行了相应的分析和研究。首先，为解决单条核酸适配体检测NSCLC患者CTC效果不佳的问题，我们尝试将之前筛选的多条适配体进行配对组合，用于临床NSCLC患者血样的检测。结果证实，适配体组合可以有效提高患者的CTC检出，检测结果与患者的临床治疗有良好的相关性。该研究首次将核酸适配体成功的应用于临床NSCLC患者的CTC检测，证实了核酸适配体组合在CTC检测中的意义和价值；其次，对惯性芯片进行了优化并用其对CTC进行了富集，该芯片由环状的双螺旋通道组成，通过细胞流动惯性的差别实现白细胞与CTC的分离，由于无需对细胞做染色标记，所以富集到的细胞更方便进行体外培养和分子标志物的分析。在NSCLC患者血样的检测过程中，采用1ml外周血，CTC的检出率为90%，且检出情况跟患者的治疗有很好的相关性；最后，我们尝试将数字PCR应用于胸水ctDNA的检测之中，结果发现，数字PCR的检出率得到了极大提升（与测序相比对为75.4% vs. 43.8%，P < 0.0001，与ARMS相比为61.3% vs. 38.7%，P=0.016）。统计学分析显示，数字PCR检测阳性的患者有更高的客观有效率（57.9% vs. 16.7%，P=0.032）。与测序结果相比，生存曲线分析证实数字PCR检测阳性的患者有更长的无进展生存期（8.0 vs. 2.0 months，P=0.0001）。以上结果在胸水标本中证实了ddPCR的临床价值，而在此实践过程中所获得的经验则有利于我们更好的应用这个检测。上述三方面的工作建立了切实可行的CTC检测和ctDNA检测的技术方法，使我们对于NSCLC患者的液体活检工作有了更一步的认识和理解，为今后在临床工作用应用这些技术解决患者的实际问题奠定了基础。