人精原干细胞诱导分化为成熟肝细胞及其信号转导的研究

人肝细胞移植和生物型人工肝为肝病的治疗展现出诱人的应用前景。人肝细胞来源的严重匮乏是限制肝细胞移植和组织工程的广泛应用的关键问题。本项目将人精原干细胞体外培养转化(conversion)为多能性人的类胚胎干细胞（ES-like cells）。采用不同的条件培养基诱导人的类胚胎干细胞逐步定向分化为肝干细胞、小肝细胞和成熟肝细胞。从形态特征和生化表型对人肝干细胞、小肝细胞和成熟肝细胞进行鉴定，并检测和评估成熟肝细胞的体外(In vitro)和在体(In vivo)功能。本项目将建立人精原干细胞诱导生成人肝干细胞的技术平台，高效诱导人肝干细胞定向分化为形态、生化表型和有功能的成熟肝细胞，为肝病的细胞治疗和组织工程提供重要的细胞来源和新的途经。肝脏的发育机理尚不完全清楚。本项目将探明类胚胎干细胞定向分化为成熟肝细胞的Ras/ERK1/2和Smad2/3信号转导通路，为阐释肝脏发育提供新的分子机理。

供体肝脏和肝细胞的严重短缺是肝脏疾病治疗面临的最大难题。肝外组织和干细胞来源可作为肝细胞的重要来源，为肝病的治疗带来新的希望。但是，未见报道精原干细胞生成有功能和成熟的肝细胞。我们提出新的科学假说：精原干细胞可转分化为有功能的成熟肝细胞。我们发现小鼠精原干细胞首先转分化为肝干细胞，其形态与超微结构和生化表型与肝干细胞相似。精原干细胞来源的肝干细胞可诱导分化为小肝细胞，它们表达肝细胞的标记，但对胆管上皮细胞标记的表达减弱。精原干细胞来源的小肝细胞进一步分化为成熟肝细胞，它们具有原代肝细胞的形态特征和超微结构，并表达成熟肝细胞的基因和蛋白标记，但不表达胆管上皮细胞标记。并且，精原干细胞来源的成熟肝细胞具有分泌白蛋白、合成尿素、吞噬与排泄吲哚菁绿功能。此外，与精原干细胞相比，转分化的肝干细胞和成熟肝细胞的ERK1/2和Smad2磷酸化表达上升。Cyclin A、cyclin B和cyclin E表达在精原干细胞来源的肝干细胞和成熟肝细胞有所降低。同时，我们利用条件培养基和“三步诱导法”首次将人精原干细胞转分化为成熟和有功能的肝细胞。人精原干细胞在形态上转分化为肝干细胞，并共表达肝细胞和胆管上皮细胞的多种标记，表明其有双分化潜能。人精原干细胞来源的肝干细胞进一步诱导分化为成熟肝细胞，它们高水平表达肝细胞的标记，如CK8、CK18、ALB、AAT、TF、TAT和肝药代谢酶CYP1A2等，而不表达胆管上皮细胞的标记如CK7 或 CK19。该成熟肝细胞具有原代肝细胞的形态特征和超微结构，并表达成熟肝细胞的基因和蛋白多种标记，但不再表达胆管上皮细胞标记。值得关注的是，人精原干细胞来源的成熟肝细胞具有分泌白蛋白、去氨和合成尿素、吞噬与排泄吲哚菁绿等功能。并且，β-CATENIN与多种转录因子HNF4A、FOXA1 和GATA4的表达在人精原干细胞转分化为成熟肝细胞的过程升高。此外，我们发现人精原干细胞与肝间质细胞共移植在肾包膜可在体内转分为成熟肝细胞。综上所述，精原干细胞通过ERK1/2、Smad2/3和β-CATENIN信号通路转分化为肝干细胞，并进一步分化为形态、生化表型和有功能的成熟肝细胞。本研究为成熟肝细胞在肝脏疾病的治疗和药物毒性筛选提供了一个新的细胞来源，并为阐明肝脏发育和细胞重编程提供了新的分子机制。