金欣口服液对RSV活化诱导的TLRs信号转导通路作用机制研究

临床研究已证实金欣口服液是治疗小儿病毒性肺炎的有效药物。前期研究结果提示，金欣口服液含药血清可能通过凋亡相关基因Fas/FasL、Bcl-2和Bax途径抑制或促进凋亡实现抗病毒作用。国内外研究证实，Toll样受体家族在调节机体天然免疫和获得性免疫反应中扮演着重要角色，鉴于中药复方作用的多靶点性，本项目拟从RSV活化诱导的Toll样受体介导信号转导通路着手，探讨金欣口服液对病毒诱导的TLR3、TLR4和TLR7信号转导通路的作用机制，以及对通路中涉及的MyD88、TRIF、TRAF、TAK1、IRF等关键信号枢纽和分泌的相关细胞因子IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ等的影响，并采用激光共聚焦扫描显微技术、基因体外转录、Real-time PCR、Western Blot、ELISA等先进实验技术，以求阐明金欣口服液发挥抗病毒作用潜在干预的信号转导途径。

本课题基本按照研究计划实施。饲养BALB/c小鼠，以RSV滴鼻感染并以JXL治疗，于首次滴鼻后24、72、144小时取肺组织及支气管肺泡灌洗液（BALF）。培养RAW264.7细胞，以RSV感染24h并采用金欣口服液含药血清进行干预，分别收集细胞及上清液。qPCR技术检测发现JXL能显著抑制肺组织及培养细胞中RSV-M mRNA表达。肺组织病理切片显示，模型鼠肺炎病理改变随着时间延长越明显，JXL可显著改善病变，减轻肺炎程度。qPCR及Western Blot检测肺组织与培养细胞TLR3、TLR4、TLR7及下游关键分子与负反馈调节分子的mRNA及蛋白表达变化：肺组织检测结果发现JXL可显著下调感染后早、中期RSV诱导的TLR3、TRAF3、IRF3、SOCS1高表达而显著上调晚期诱导的TLR3、TRAF3、IRF3低表达；可显著抑制中、晚期RSV诱导的TLR7、MyD88、NF-κB高表达，加强晚期RSV诱导的TBK、IRF7高表达及TRIF、TRAF6的低表达；可显著下调感染各期RSV诱导的A20高表达。体内外实验结果基本一致。免疫荧光/激光共聚焦技术进一步证实JXL能显著抑制RSV诱导的TLRs高表达及NF-κB细胞核转位。ELISA法检测BALF与细胞上清液中炎症细胞因子，发现JXL能显著下调早、中期RSV诱导的IFN-β、TNF-α、IL-6的高表达，加强晚期IFN-β的高表达。采用siRNA干扰MyD88表达，正常及RSV感染细胞MyD88、NF-κB 表达显著下降，而RSV诱导的IRF3高表达较转染前无明显变化；JXL可显著降低MyD88 siRNA转染后RSV诱导的IRF3高表达。研究结果表明，JXL能明显减轻RSV感染小鼠的肺部炎症，是治疗RSV感染的有效药物。其作用机制可能主要通过抑制RSV诱导的急性期TLR3/IRF3信号通路过度激活从而防止IFN-β的高表达引起免疫损伤，同时维持IFN-β表达发挥抗病毒作用；JXL对TLR4(TLR7)/MyD88/NF-κB/炎症因子通路也有一定的调控作用；此外可能通过调控负反馈因子SOCS1、A20间接稳定激活TLRs通路。本项目首次结合固有免疫模式识别受体TLRs信号通路，研究中药复方抗RSV病毒机制，进一步揭示了金欣口服液治疗RSV肺炎的疗效机理，同时为中药抗病毒药效学研究提供了新的思路和方法。