基于ER介导的MAPK信号通路研究硼影响大鼠睾丸发育和精子发生的作用机制

As an essential element, boron affects the development and function of male reproductive system through regulating ER. Many studies demonstrated that boron deficiency impaired development of reproductive organs and an appropriate amount of boron was beneficial effects on testis development and spermatogenesis, while high dosage elicit apparent damage even toxicity. Our previous researches using transcriptomics illustrated that boron not only affected testis development and spermatogenesis and also regulated the location and expression of the estrogen receptor (ER), but the regulation mechanism of boron was unclear. In current studies, it has confirmed that MAPK signal pathway played an important role in the spermatogenesis and boron could regulate ER-mediated MAPK signal pathway. Thus, we hypothesis that boron might affect the spermatogenesis by the ER-mediated MAPK signal pathway. In this study, techniques of gene silence, RT-PCR, IFA, immunoblotting techniques, specific inhibition, RNA interference, immunohistochemistry, ELISA, chip technology and flow cytometry are used to study the mechanism of the boron effect the testis development and spermatogenesis. This study will provide a reliable theoretical basis for boron application and safe evaluation in human and animal nutrition.

硼是人和动物机体可能必需微量元素，可促进雌激素合成分泌，对生殖器官发育及功能维持有重要作用；硼缺乏可致生殖器官发育异常，适量补硼可促进睾丸发育和精子发生，高剂量硼则有不良影响甚至损伤作用，硼对动物生殖健康的影响已备受关注。课题组前期研究及转录组学测序发现，硼在影响睾丸发育和精子发生同时，对睾丸雌激素受体（ER）表达和MAPK信号通路激活有明显作用，可显著影响通路上下游差异基因数量；MAPK通路在睾丸发育和精子发生中起重要调控作用。这提示硼可能通过ER介导MAPK通路来影响睾丸发育和精子发生。本项目在前期研究基础上，综合分析国内外研究结果，以硼影响睾丸ER表达为切入点，以MAPK通路为研究核心，通过特异性阻断、RNA干扰、细胞培养、免疫组化、ELISA、流式细胞术和芯片技术等现代生物技术手段，研究并揭示硼影响大鼠睾丸发育和精子发生的作用机制，为硼在人和动物营养方面应用及安全评价提供科学依据。

硼是人和动物机体可能必需微量元素，可促进雌激素合成分泌，对生殖器官发育及功能维持有重要作用；硼缺乏可致生殖器官发育异常，适量补硼可促进睾丸发育和精子发生，高剂量硼则有不良影响甚至损伤作用，硼对动物生殖健康的影响已备受关注。本项目通过特异性阻断、细胞培养、免疫组化、ELISA、流式细胞术、转录组测序和生物信息学等现代生物技术手段，研究并揭示硼影响大鼠睾丸发育和精子发生的作用机制，为硼在人和动物营养方面应用及安全评价提供科学依据。试验结果表明，低剂量硼（≤5.0 mmol/L）可以促进 Sertoli Cell 的增殖，高剂量硼（≥5.0 mmol/L）可以抑制Sertoli Cell 的增殖，并表现一定的毒性作用。经进一步研究硼对ER阻断前后Sertoli Cell 凋亡、增殖及细胞因子的影响，发现硼对 PHTPP 和 G15 阻断剂处理的 Sertoli Cell 有一定的影响，揭示硼对Sertoli Cell 的作用机制可能是通过这两种雌激素通路来调节对机体生殖功能的影响。体内试验结果表明，硼添加量为10 mg/L时可以提高种公猪精液品质。饮水中添加10-80 mg/L硼可能改善机体血清生化指标，促进ER蛋白的表达；PHTPP和G-15阻断可影响支持细胞的ER蛋白和MAPK通路的表达并影响硼对支持细胞的作用；0.75 mM硼可降低支持细胞的抑制率，p38和JNK阻断均可影响支持细胞的抗氧化功能。体外培养大鼠IEC-6细胞，添加PI3K特异性阻断剂LY294002使IEC-6细胞的增殖率受到抑制，凋亡率显著升高，同时SIg A、ZO-1和Occludin的表达量也降低，对IEC-6细胞产生了毒性作用；试验在添加硼处理的同时，通过阻断AKT信号通路，发现硼对PI3K细胞的影响产生了改变，说明硼可以通过AKT通路对IEC-6细胞的增殖、凋亡及免疫屏障功能产生作用。通过对大鼠睾丸转录组测序结果分析，鉴定了与睾丸健康和生殖发育有关的重要基因和生物通路，发现不同硼水平下大鼠睾丸组织差异表达基因主要与能量代谢、脂质代谢、氧化还原活性等生物过程有关；这些基因主要影响细胞线粒体、核糖体和溶酶体功能，从而影响了精子的发生和睾丸的功能。此外，我们发现胰岛素样生长因子可能受到硼元素影响。