基于亚纳米分辨透射电子显微学的DNA单分子测序技术研究

Genome sequencing technology has irreplaceable importance for public health, personal health prediction and diagnosis, epidemic diseases, etc. It is considered the only way to achieve individualized (personalized) medicine. The ultimate goal is to develop a fast, unlabeled, single-molecule, whole genome sequencing technology. However, the development of sequencing technology has experienced three generations, there are still many technical challenges and bottlenecks such as, the third generation single molecule sequencing technology is still in the prototype stage. Transmission electron microscopy represents the state-of-art microscopic resolution up to today, and can provide abundant morphological and structural information from specimens. Therefore, the current project proposes a combination of single molecule DNA sample preparation technique and sub-nanometer resolution, spherical aberration-corrected transmission electron microscopy imaging technology, intending to directly image DNA at the Angstrom-resolution: some 1 nm or less atomic clusters are to modify the DNA bases with specificity; By using TEM under various imaging modes and with the help of additional information, single molecule DNA strand will be imaged; Moreover, the general techniques of interpreting and translation TEM images into DNA sequence is going to be developed. The technical principles are to be illustrated. The goal of this proposal is to achieve a direct reading technology based on transmission electron microscopy, to construct a platform which may realize universal, rapid, single molecule DNA sequencing.

基因组测序技术对于公共卫生、个人健康状况预测、流行性疾病及危险性诊断等具有其他技术不可替代的作用，是实现个体化（个性化）医疗的必经之路，其最终技术目标是实现单分子、非标记的全基因组快速测序。然而，测序技术发展至今共经历三代，该目标仍存在诸多技术瓶颈和挑战，第三代单分子测序技术仍处在原理摸索阶段。透射电子显微学的微观分辨率代表着当今人类所能够直接观察到的最小尺度，并且能够提供丰富的样品形貌和结构信息。因此，本项目提出单分子DNA样品处理技术和亚纳米分辨球差校正透射电子显微学成像技术结合，拟对DNA进行亚纳米尺度分辨的直接成像；通过1纳米以下的原子簇对碱基进行特异性修饰，利用TEM下不同成像模式和辅助信息进行成像；发展原子簇电镜图像序列进行反演识别的一般性方法和技术，最终确定和还原DNA碱基序列，并阐释其技术原理。最终目标是实现的基于透射电子显微学直接读取技术的普适性的DNA单分子快速测序平台。

基因组测序技术对于公共卫生、个人健康状况预测、流行性疾病及疾病危险性诊断等具有其他技术不可替代的作用，是实现个体化医疗的必经之路。基因组测序技术的最终目标是实现单分子、非标记的全基因组快速、低成本测序。而透射电子显微学的微观分辨率代表着当今人类所能够直接观察到的最小尺度，并且能够提供丰富的样品形貌、结构和成分等信息。.本项目按照任务书要求，运用铜网键合和MEMS加工工艺，分别建立了两套原位液体透射电镜样品加载平台；优化了针对原位液体透射电镜成像的仪器设置、成像参数和条件；在电镜内液相下通过原位还原制备了Ag、Cu、Pb等适用于生物样品成像标记的金属纳米颗粒（原子簇）；针对水相体系下的金属颗粒体系、有机-金属复合体系、生物酶体系和DNA-纳米颗粒体系的动态演变分别进行了实时表征，并与非原位透射电镜的结果进行比较，揭示了其结构、成分动态演变规律；基于DNA-金属颗粒特异性相互作用，在LC-TEM下实现了对具有特异性结合片段的DNA的识别和表征；基于DNA-金属颗粒的特异性相互作用，利用电化学手段分别建立了两种（发夹型和氧化石墨烯吸附）ssDNA电化学传感器，实现了高灵敏、高线性范围的ssDNA检测；使用分子动力学模拟方法对DNA-金属颗粒相互作用的动力学和热力学开展了研究，揭示了DNA-金属颗粒复合物的形成过程和机制。.本项目对DNA的基本结构及其与金属原子的相互作用进行了原位、动态、模拟真实生物环境的液体高分辨透射电镜研究，并使用电化学和计算机模拟等方法进行了辅助表征和机理研究。项目的开展实现了特定片段DNA序列的识别，并为任意碱基序列DNA的直接读取测序打下了良好基础，对推动全基因组快速测序和个体化医疗的发展起到了推动作用。