基于低分子量透明质酸的乙肝疫苗微针的构建及其经皮免疫效应和机制研究

Current hepatitis B immunization has been shown to cause pain, induce weak cellular immune response, and the aluminum adjuvants can cause local reactions. Novel dissolvable microneedles could destroy the stratum corneum barrier function, and deliver the vaccine to the epidermis and dermis which are rich of antigen presenting cells. So, it is expected to improve the effectiveness and reduce adverse reactions of the vaccine by using non-invasive dissolvable microneedles. However, there is no research about hepatitis B vaccination with dissolvable microneedles yet. In this project, endogenous low molecular weight hyaluroncd acid (LMWHA) is used as both the microneedle material and immunoadjuvant in the dissolvable microneedles. Further, LMWHA and chitosan crosslinked nanospheres are prepared and loaded into the dissolvable microneedles. The immune enhancement effect and mechanisms of LMWHA and LMWHA-chitosan crosslinked nanospheres on hepatitis B vaccine are studied. This project is expected to solve the key issues of current dissolvable microneedles in transcutaneous immunization. Also, it is expected to establish and develop new concepts and methods in transcutaneous delilvery of hepatitis B vaccine.

目前的乙肝疫苗接种存在着注射引起疼痛、细胞免疫应答很弱、铝佐剂可引起局部反应等缺点。可溶解微针免疫技术利用微针破坏角质层的屏障作用，将疫苗递送到表皮和真皮中富含的抗原呈递细胞，有望在实现无痛免疫的同时提高疫苗的效力、降低不良反应。但是，至今尚没有乙肝疫苗可溶解微针的研究报道。本项目立足于免疫学、药剂学和BioMEMS科学的交叉，利用内源性的低分子量透明质酸（LMWHA）能够诱导抗原呈递细胞活化的功能，提出并建立同时以LMWHA为基材和免疫佐剂制备乙肝疫苗可溶解微针的新方法和新技术；利用LMWHA与壳聚糖交联形成的纳米微球，提出并建立包裹纳米微球的可溶解微针经皮免疫新方法和新技术。并且在此基础上开展LMWHA及其纳米微球在经皮免疫中的佐剂效应和机制研究。本项目的实施为解决可溶解微针经皮免疫中存在的的关键问题提供了新的解决思路，并且有望建立和发展乙肝疫苗经皮免疫的新概念、新方法。

目前的乙肝疫苗接种存在着注射引起疼痛、细胞免疫应答很弱、铝佐剂可引起局部反应等缺点。可溶解微针免疫技术利用微针破坏角质层的屏障作用，将疫苗递送到表皮和真皮中富含的抗原呈递细胞，有望在实现无痛免疫的同时提高疫苗的效力、降低不良反应。本项目建立了以内源性的低分子量透明质酸为基材制备疫苗可溶解微针的新方法，对其理化性质和安全性进行了研究。采用本项目设计和搭建的微针强度测试仪，使微针的机械强度指标实现了量化，优于文献报道的同类型可溶解微针；通过皮肤穿刺实验证明只需0.178N/针的力度即可将微针刺入皮肤（猪皮），并且在拉力计的最大作用力（0. 296 N/针）下，微针也不会折断，这表明以LMWHA为基材制备的可溶解微针具有较理想的机械强度；通过激光共聚焦显微镜（CLSM）成像的方法，表明650μm高的可溶解微针作用于皮肤，其穿刺深度为250 – 300 μm；微针载药量随制备微针时加入的疫苗浓度和体积增大而增大；通过研究微针针孔的愈合时间和微针材料的免疫原性，初步证明了可溶解微针的安全性。本项目通过研究阳离子脂质体载入可溶解微针后自身性质（粒径、包封率、释放性能）的变化，以及可溶解微针疫苗贴片的制作过程对模型疫苗OVA稳定性的影响，证明了疫苗/纳米载体可溶解微针给药系统的可行性。通过小鼠体内免疫实验显示，在取得相同免疫效果时，疫苗/纳米载体可溶解微针的实际给药剂量仅为肌肉注射的60%。进一步地，本项目将阳离子脂质体可溶解微针给药系统应用于乙肝DNA疫苗，对DNA疫苗在皮肤内的表达情况、产生的特异性抗体水平、细胞免疫效果及其作用机制进行了研究。结果表明，在乙肝DNA疫苗经皮免疫产生有效抗体水平的基础上，阳离子脂质体可以提高DNA疫苗诱导免疫反应的能力，并提高CpG OND佐剂对免疫反应类型的调节能力。本项目在国际同行中率先证明了可溶解微针透皮技术用于乙肝疫苗经皮免疫的可行性，为新型阳离子脂质体和CpG佐剂在微针经皮免疫中的应用提供了依据，并为新型乙肝DNA疫苗的免疫途径开辟了新方向。