白刺链霉菌CT205 VOCs-NVOCs 协同防控土传枯萎病机制研究

Both the volatile (VOCs) and non-volatile organic compounds (NVOCs) produced by soil microorganisms play the important roles in influencing other microbes and plants. Previous study shows that VOCs and NVOCs produced by a Streptomyces albospinusstrain CT205, which can efficiently control Fusarium wilt disease of cucumber, have a synergic effect on suppression of the growth of the fungal pathogen Fusarium oxysporum in the laboratory conditions. However, the mechanisms of synergic inhibitory effect on Fusarium pathogen growth have scarcely been studied. In this project, we will first identify the main VOCs and key antimicrobial substance of NVOCs of S. albospinus CT205by using the GC-MS and HPLC methods. Second, in order to decipher the synergic mechanism of VOCsand NVOCs, we will test the effect of key components of VOCs and NVOCs alone or in combination on the growth, production of fusaric acid and cell wall degradation enzymes activities of F.oxysporum，and the induction of cucumber plant resistant enzymes activities and the marker genes expression of salicylic acid, jasmonic acid and ethylene pathways. Finally, the effect of soil environmental factors, such as root exudate compounds of cucumber, pH and temperature on the production of VOCs and NVOCs of S. albospinus CT205 will be studied and the synergy effect of VOCs and NVOCs on control of cucumber Fusarium wilt will be carried out in greenhouse conditions. We expect that results of the research will provide a theoretical guidance and technical support for increasing the biocontrol efficiency and stability of soil borne Fusarium disease with S. albospinus CT205 in field conditions.

微生物难挥发性有机物（NVOCs）和易挥发性有机物（VOCs）在土壤中均发挥重要作用。研究发现防控土传黄瓜枯萎病生防菌Streptomyces albospinus CT205产生的VOCs和NVOCs配合能显著提高抑制土传枯萎病菌效果，两者是否有协同作用以及协同机制尚不明确。拟通过GC-MS和HPLC等方法分别鉴定VOCs主要成分和NVOCs中关键抑菌物质；研究生防菌CT205产生的VOCs与NVOCs关键组分单独或配合对病原菌生长、致病毒素产生和真菌细胞壁降解酶活性、对植物抗病相关酶活性和水杨酸、茉莉酸和乙烯抗病途径标志性基因表达的影响，阐明VOCs与NVOCs协同抑病的机制。研究土壤pH、温度等因素对CT205产生VOCs及NVOCs的影响；采用盆栽试验，验证VOCs及NVOCs协同控制黄瓜枯萎病的效果。研究结果为提高生防制剂CT205防控土传病害效果和稳定性提供理论指导及技术支撑。

微生物活性代谢产物在土壤中发挥着重要的作用。白刺链霉菌（Streptomyces albospinus） CT205代谢产生的非挥发性物质（NVOCs）和挥发性物质（VOCs）均能显著的抑制土传枯萎病原真菌的生长。通过液体发酵收集CT205代谢产物，借助溶媒萃取、薄层层析纯化代谢产物中的活性组份，结合活性组分HPLC-TOF-MS数据、紫外光谱、红外光谱、1H NMR和13C NMR数据，确定主要活性组份为环己酰亚胺（Cycloheximide，CHX）。环己酰亚胺，又名放线酮，是一种真核蛋白合成抑制剂，经其处理后的尖孢镰刀菌产生镰刀菌酸和细胞壁降解酶（纤维素酶和果胶酶）能力显著下降，致病性显著降低。通过GC-MS检测到CT205固体发酵产生14种挥发性有机化合物，其中2-苯乙醇等7种VOC对尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用。研究表明在CT205代谢产生的VOCs处理、CHX处理及复合处理（CHX+VOCs）下，黄瓜叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）酶活性较对照均显著提高。在VOCs、CHX及复合处理下，叶片中水杨酸含量较对照均显著提高，其中复合处理中水杨酸含量显著高于VOCs和CHX处理，RT-qPCR结果也显示水杨酸途径关键基因PR1的表达量显著提高，表明CT205的活性代谢产物可以诱导黄瓜产生系统抗性，抵御枯萎病的发生。同时，实验验证CHX及VOCs具有协同抑制尖孢镰刀菌孢子萌发及菌丝生长的作用。土培和盆栽实验结果表明CT205可在土壤环境中有效定殖，并通过产生活性代谢产物对芹菜根腐病、黄瓜枯萎病进行有效防控。研究同时完成了CT205基因组测序工作，表明其染色体呈线性，大小为9.76Mb，包含8734个基因，37个次级代谢产物合成基因簇，并借助基因组信息推断出环己酰亚胺在CT205中的生物合成途径，为后续相应遗传操作提供了条件。研究结果为CT205防控土传真菌病害效果和稳定性提供理论指导及技术支撑，为充分开发CT205生防潜力和应用前景打下了基础。