海南坡鹿II类MHC位点分离及其适应性变异研究

项目以海南坡鹿病理检查的富余外周血为材料，通过利用DNA公共网络数据库中II类MHC基因的共享数据和生物信息方法，设计海南坡鹿II类MHC位点的PCR扩增引物，并利用SSCP和测序技术，分离海南坡鹿的II类MHC位点。继后，利用外周血cDNA进行表达功能鉴别，确定已分离获得的II类MHC位点中的功能位点，以剔除那些不具有表达功能的假基因，从而建立海南坡鹿适应性变异研究的II类MHC分子标记系统。在此基础上，以海南坡鹿的粪便为材料，通过对MHC位点的群体检测和变异性分析，探索海南坡鹿II类MHC基因的适应性变异与种群复壮之间的关系，从而为继后揭示海南坡鹿种群复壮的分子机理，提供前期工作基础。

项目以一只海南坡鹿病理检查的富余外周血液为材料，提取了mRNA和基因组DNA，通过利用GenBank等公共网络数据库和生物信息技术，设计了海南坡鹿II类MHC基因的PCR扩增兼并引物。利用该兼并引物，结合本研究团队已建立的HURRAH技术，本项目组成功分离了海南坡鹿具有表达功能的全部7个经典的II类MHC基因（1个DRA、1个DRB、2个DQA和3个DQB），并建立了MHC位点特异性分型引物，为本项目开展“海南坡鹿适应性变异研究”奠定了基础。随后，项目组利用先期建立的粪便基因组DNA的提取方法，完成了自海南省大田自然保护区、邦溪自然保护区和甘什岭自然保护区采集的400余份野生海南坡鹿粪便样品的高质量基因组DNA的提取工作。这些群体基因组DNA经上述建立的分子标记检测后，发现海南坡鹿具有二态的DRA、三态的DRB、二态的DQA1和单态的DQA2、DQB1、DQB2。种群水平的统计分析表明海南坡鹿的寡态MHC现象是由其近期已知的严重瓶颈造成的，同时揭示虽然其位点的等位基因数量较少，但等位基因的序列多样性较高，呈现明显的正选择进化证据。这些结果表明，海南坡鹿仍有较强的栖息生境适应能力，并由此提示：加强海南坡鹿的栖息地就地保护是拯救该濒危物种的主要策略之一。