益气健脾中药对小肠上皮细胞迁移过程多胺信号通路中钙离子调控的研究

促进胃肠粘膜损伤修复是益气健脾中药作用机理之一。粘膜损伤后修复包括快速修复和慢修复过程，前者是修复的关键第一步，以损伤后细胞迁移为主，多胺调控信号通路对其起重要作用。申请人上一课题发现益气健脾中药能促进小肠上皮细胞迁移，提高多胺介导信号通路指标的水平，并对相关抑制剂的抑制有逆转作用；尤其是提高细胞内钙离子水平是修复损伤的关键指标，因此本课题围绕该通路中的钙离子调控因素进一步观察益气健脾中药的作用，在小肠上皮细胞检测：影响Ca2+的上游指标如静息膜电位、Ca2+内流驱动力、IP3、PLC-?1、TRPC1；Ca2+影响的指标如Rho GTP酶之RhoA、Rac1和Cdc42，Rho-kinase活性、MLC磷酸化，MyosinⅡ蛋白表达和分布等。在分子水平研究益气健脾中药粘膜修复较精确的调控机制。对阐述益气健脾中药治疗脾胃病科学内涵有重要意义，也为益气健脾创新药物提供研究基础。

研究背景.胃肠粘膜损伤是脾虚证的病理基础之一，胃肠黏膜保护是益气健脾中药的重要作用机制。上皮细胞迁移是胃肠粘膜损伤修复的重要步骤，课题组发现益气健脾中药白术、黄芪、党参、甘草的提取物能促进小肠上皮细胞（IEC-6）迁移，作用机制与影响多胺调控信号通路有关，尤其提高胞内Ca2+水平是关键指标，本课题围绕该通路Ca2+调控因素进一步探讨益气健脾中药的作用机制。.研究内容与结果.一、白术提取物对IEC-6细胞迁移过程多胺调控信号通路的影响.结果：①白术甲醇提取物（100、200 mg/L）能促进细胞迁移、提高多胺含量、提高Kv1.1mRNA和蛋白表达、增加Em、增加 [Ca2+]cyt、提高TRPC1 mRNA和蛋白表达、提高PLC-1 mRNA和蛋白表达；可逆转DFMO对上述指标的抑制。②若去除细胞外Ca2+（无Ca2+培养液），空白组可见明显细胞迁移抑制，白术提取物促进细胞迁移的作用也明显弱于使用Ca2+培养液时。③可提高RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA和蛋白表达，逆转DFMO对其的抑制；提高肌球蛋白II表达。结论：白术提取物促进小肠上皮细胞迁移的作用与其影响多胺信号通路有关，钙离子是关键调控因素之一。.二、白术调节IEC-6细胞迁移活性多糖成分的分离和表征.水提醇沉、DEAE纤维素柱和Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱等从白术分离可调节IEC-6细胞迁移的白术多糖YY13008和YY21714，鉴定和表征其分子结构。结果：通过酸水解、HPLC、GPC-MALLS、FT-IR、ESEM、1D-和2D-NMR等及波谱数据分析，表明YY13008和YY21714是线团型均一性多糖组分，绝对分子量6546和2898，分子结构是由大量果糖单元以(2→1)果糖苷键，终末端以(1→2)葡萄糖苷键连接构成的果聚糖，其可使DFMO所致的细胞迁移抑制恢复至正常水平。为探讨白术多糖调节细胞迁移的药效物质基础提供了参考。.三、四君子汤多糖对IEC-6细胞迁移过程多胺调控信号通路的影响.结果：四君子汤多糖（40160mg/L）可促进细胞迁移，提高kv1.1 mRNA 和蛋白表达水平，提高膜电位超极化水平，增加多胺（精脒和精胺）含量、提高TRPC1 mRNA及蛋白表达、提高PLC-1蛋白表达和IP3含量、增加[Ca2+]cyt，可逆转DFMO对上述指标的抑制；可改善无钙