强迫前列腺癌细胞有氧糖酵解与前列腺癌细胞干性的相关关系

Stem cells like embryonic, hematopoitic, adult and induced pluoripotent stem cells selectively produce ATP through glycolysis, even under normoxia condition where there is higher level of oxygen than physiological condition, and such an aerobic glycolysis feature in these cells is ralated to their cell stemness. Tumor cells have similar feature, known as Warburg effect. However, it is not clear whether such a glycolysis priority in tumor cells is a driving force for stemness maintaining and propagation of cancer stem cells. Increasing evidence indicates that lower level of pyruvate dehydrogenase is significantly associated with tumor cells′ aerobic glycolysis and tumor cell stemness, possibly due to special regulations of intermitent metabolites of glycolysis. Therefore, it is of great interest to explore the molecular mechanism behind this correlation. Based on literature report and our laboratory experience, we plan to knockout the key gene controlling the entry of glucose into mitochndrial tricarboxylic acid cycle (TCA), pyruvate dehydrogenase, and its anaplerosis gene pyruvate carboxylase, in oder to force these cells to obtain ATP through glycolysis, and then study how the stemness of these cells is changed and related molecular links, exploring whether this is an option to obtian, maintain and propagate prostate cancer stem cells in vitro, and providing novel model for further clinical cancer stem cell targeting study.

不同的干细胞都会选择性地通过糖酵解获取能量，而这种特性与这些细胞的干性程度相关。肿瘤细胞也选择性地进行有氧糖酵解。但是这种选择性与肿瘤细胞的干性程度的因果关系还不清楚。有研究表明肿瘤细胞低水平的丙酮酸脱氢酶活性可能是其加强糖酵解和维持干细胞特性的重要环节，提示如果在体外研究体系中提高肿瘤细胞的有氧糖酵解可能会上调这些细胞的干性，甚至获得高纯度的肿瘤干细胞。其机理可能在于其大量糖酵解过程中产生的中间代谢产物的特殊调控功能。要澄清上述可能的分子机理，敲除葡萄糖进入三羧酸循环的关键酶基因的分子生物学研究就很有必要。据此我们设计了敲除细胞丙酮酸脱氢酶α1基因，以及进一步敲除丙酮酸进入三羧酸循环补偿途径的关键酶丙酮酸羧化酶，强迫前列腺癌细胞进行有氧葡萄糖酵解，以便研究糖酵解与细胞干性的调节和维持的相关关系及其分子机理，探索体外获得高纯度的肿瘤干细胞、筛选肿瘤干细胞的靶向标志分子的新途径。

本课题设计了敲除细胞丙酮酸脱氢酶α1基因强迫前列腺癌细胞进行葡萄糖酵解，从而研究其与细胞的干性调节的相关关系， 以及进一步研究基因敲除肿瘤细胞的三羧酸循环代偿机制。本试验的最终目标是澄清强迫肿瘤细胞进行有氧葡萄糖代谢是否能够迫使肿瘤细胞进一步去分化及其分子机理，从而获得高纯度的肿瘤干细胞，为后续的临床肿瘤干细胞靶向治疗提供平台，同时筛选肿瘤干细胞靶向治疗的靶向标志分子。我们应用TALEN技术对人前列腺癌细胞系LnCap和PC3进行了PDHA1基因的敲除实验， 结果发现PC3细胞系转染效果不理想， 在经过一年多的反复实验后放弃了对PC3细胞系的基因敲除。而LnCap细胞的PDHA1基因敲除进展顺利。PDHA1基因敲除后的LnCap细胞的干性的确大大上调，而且细胞的放疗和化疗耐药性也显著增加，细胞更类似于肿瘤干细胞。 研究中，PDHA1基因敲除的PDHA1细胞系没有发现显著意义的丙酮酸羧化酶基因的代偿性上调。 不过，通过对PDHA1基因敲除的LnCap细胞的进一步代谢和代谢组学研究发现，这些细胞更加嗜好谷氨酸。我们也对PDHA1基因敲除前后的LnCap细胞通过碳标记的葡萄糖以及氮标记的谷氨酸的放射追踪核磁共振研究发现大量的谷氨酰胺补偿性进入三羧酸循环而使PDHA1基因敲除的细胞可以幸存下来， 而这些细胞的生存能力的大大增加也与这些细胞的谷氨酸氨酶1以及谷氨酸脱氢酶1的上调相关， 而这两种相关基因的上调也在前列腺癌的临床材料中证明有显著的临床意义。在研究进行的第二年， 我们发现，就肿瘤细胞的干性调节上，线粒体丙酮酸载体（MPC）可能具有丙酮酸脱氢酶相似的功能，因此我们也将MPC的基因功能研究扩充到本课题。我们的MPC基因功能研究的部分结果已经表明抑制或者将MPC1/MPC2的基因敲除后的前列腺癌细胞与PDHA1基因敲除的LaCap细胞相似。本课题的结论是LaCap前列腺癌细胞在PDHA1基因敲除后更加类似于肿瘤干细胞，而且这些干细胞样肿瘤细胞更加依赖于谷氨酰胺的分解代谢。如何特异性杀死这些干细胞样肿瘤细胞， 而对机体正常细胞没有大的副作用将是我们课题组进一步研究的课题之一。